人乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)是嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)正嗜肝病毒属病毒,具有肝脏嗜性,可引起人肝脏急性、慢性感染,肝硬化和肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。流行病学资料和诸多研究结果证明HBV感染可能是HCC发生的首要诱因,这与肝细胞的生长、凋亡和再生的调控特点,HBV编码的X蛋白(HBx)的结构和功能特性有着密切的关系。HBx蛋白主要通过与细胞蛋白的相互作用来调控和激活宿主细胞和病毒基因的转录表达,影响细胞凋亡,抑制细胞中受损DNA的外切修复反应以及激活细胞中信号转导通路(如MAPK、JAK、STAT)的级联反应,以及调控病毒自身的复制与增殖等。到目前为止,已经发现的与HBx蛋白相互作用的细胞和其他病原蛋白有几十种,功能范围涉及到肝细胞的生长、调亡和再生过程中的信号转导及其调控,肝细胞的基因转录,DNA的修复及其调控,大分子在核与胞浆间穿梭等。目前还没有足够的证据阐明HBx蛋白在HCC的发生与发展中的确切分子机制。因此,分离鉴定新的与HBx相互作用的宿主或其它病原生物的蛋白因子、阐明其功能等,是揭示HBx诱发HCC发生机制的基础。 为了进一步探索HBx在诱发HCC的功能,本研究采用酵母双杂交系统等方法与手段分离和鉴定新的与HBx蛋白相关的细胞蛋白,揭示其生物学功能。我们从由HBV感染并发HCC患者的血清中分离和克隆HBV病毒基因组,并对其基因组进行了核苷酸序列测定和遗传演化分析。研究结果表明所得到的HBV分离株WhuTj-37属于已经确认的8个HBV基因型中的B亚型,是我国最为流行的HBV分离株。通过表达HBx蛋白的酵母细胞表型鉴定证实,HBx蛋白在酵母细胞内没有自激活活性,对酵母细胞也没有毒性作用,因此,我们用WhuTj-37分离株的HBx基因构建酵母双杂交系统Bait载体以及其他与本研究相关的表达载体。通过对人肝细胞cDNA文库的筛选,初步获得80多个阳性克隆。经过插入片段的PCR及PCR产物的酶切鉴定、AD质粒的酶切鉴定等剔除了部分重复克隆,再经过AD质粒和HBx的Bait质粒的共转化酵母细胞,进一步验证HBx蛋白和这些AD插入片段编码多肽的相互作用。随后测定了AD插入片段的核苷酸序列,借助Genbank核苷酸序列数据库搜索AD插入片段代表的宿主细胞基因,结果得到了22个与HBx在酵母细胞内相互作用的细胞基因。为了进一步验证这些细胞基因编码蛋白与HBx蛋白相互作用,针对第一次筛选得到的9个蛋白,设计一条含有T7启动子和HA表达标签多肽序列的引物和扩增AD插入片段的引物一起扩增这些AD插入片段,作为体外转录和翻译的模板。利用体外转录和翻译偶联系统转录和翻译HBx蛋白和AD插入片段编码多肽,并用同位素标记体外翻译的AD插入片段编码的多肽。进行的体外免疫共沉淀试验研究结果证明HBx蛋白在体外