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1目的：白血病是造血干细胞的增殖和分化失控引起的造血系统恶性肿瘤。研究证明，在白血病患者骨髓内存在少量具有自我更新和异常分化能力的白血病干细胞（leukemia stem cells，LSCs），其在白血病的发生、发展和复发的过程中起着非常重要的作用，同时也是白血病药物抵抗的关键。最新理论认为，有效杀灭LSCs是根治白血病的重要途径。当归是中医临床“补血活血”要药，当归多糖（Angelica SinensisPolysaccharide，ASP)是其重要药效成分，具有改善免疫功能，促进血液细胞功能，抗辐射，抗肿瘤等药理学作用。我们前期研究证明，ASP有明显延缓造血干/祖细胞衰老和促进人白血病细胞衰老的“双向调控”或“扶正祛邪”作用。ASP能否诱导LSCs衰老？能否在干细胞水平发挥“扶正驱邪”或“双向调控”作用？目前尚未见文献报道，如果这一科学问题得以阐释将为白血病的治疗提出了新的策略和途径。本研究探讨ASP调控人LSCs衰老的作用及其机制，旨在为寻找能有效诱导肿瘤干细胞衰老，且低毒高效的天然药物诱导剂提供理论和实验室依据，为白血病治疗提供新的手段。方法：1. CD34+CD38－LSCs分离纯化与鉴定：采取初诊未经任何治疗的急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)患者骨髓，密度梯度离心法收集骨髓单个核细胞(BMNC, bone marrow mononuclearcells)，免疫磁性分选法（MACS）分选CD34+CD38－细胞群，流式细胞术测定细胞分选纯度，混合集落培养法检测白血病干细胞增殖与分化能力。2. ASP诱导对CD34+CD38－LSCs增殖能力检测：收集分选的CD34＋CD38－LSCs，ASP组：每孔加入终浓度为0～80μg/ml的ASP；对照组：常规培养，两组细胞分别培养48h，加入CCK-8，酶标仪检测450nm的吸光度值，评价细胞增殖能力。3. ASP诱导CD34+CD38－LSCs衰老相关指标检测：分别收集对照组和40μg/ml的ASP诱导48h的CD34+CD38－LSCs。⑴流式细胞术检测两组细胞的细胞周期分布变化；⑵SA-β-Gal酶染色检测衰老CD34+CD38－LSCs百分率；⑶甲基纤维素半固体培养检测CD34+CD38－LSCs形成集落的能力；⑷利用透射电子显微镜检测LSCs细胞超微结构的变化。4. ASP诱导CD34+CD38－LSCs衰老相关分子生物学检测：分别收集对照组和ASP诱导的CD34+CD38－LSCs。1）定量PCR分析两组细胞衰老相关基因p16和Rb表达水平变化；2）Western Blotting检测调控细胞衰老和细胞周期相关蛋白P21、P16、CDK4和CyclinE变化；3）TRAP-PCR检测细胞端粒酶活性；4）Southern Blotting检测细胞端粒长度变化。5.构建人急性髓系白血病小鼠模型：细胞移植前两天每天给予NOD/SCID小鼠腹腔注射环磷酰胺2mg/只，qd×2；细胞移植当天，无菌条件下通过尾静脉给每只小鼠移植2×107个LSCs/500μl，通过小鼠尾静脉给予对照组的小鼠输入相同体积的生理盐水，移植4周连续。移植过程中每天同一时间观察小鼠生长状况，在移植结束2周采外周血计数白细胞总数及分类计数，处死小鼠检测肝、脾指数与骨髓细胞数等观察移植效率。6. ASP对白血病模型小鼠治疗效果的检测：确定NOD/SCID小鼠白血病模型复制成功后开展实验。ASP组：给小鼠腹腔注射200mg/kgASP，qd×14；Ara-c组：给小鼠腹腔注射2.5mg/kg Ara-c，qd×14；联合用药组：给小鼠腹腔注射200mg/kgASP＋2.5mg/kgAra-c，qd×14；对照组：腹腔注射等时与等量生理盐水qd×14。评价ASP对移植性急性髓系白血病模型小鼠的治疗效果。结果：1.免疫磁珠分选法可高效分选出人源白血病骨髓CD34+CD38－细胞群，相差显微镜下显示，细胞形态丰满、高透明度、强折射性；分选后的CD34+CD38－细胞群纯度达（91.15±2.41%）。台盼蓝染色显示细胞活性高（95.42±3.52%）；体外集落形成能力较分选前明显提高（P＜0.05）。2. ASP体外作用CD34+CD38－细胞群48h，可有效抑制其增殖且呈时间与浓度依赖性（P＜0.05）；3.40μg/ml ASP作用48h，CD34+CD38－细胞群的SA-β-Gal半乳糖苷酶染色阳性细胞率明显升高（P＜0.01）；细胞周期呈现出明显的G0/G1期阻滞；集落形成能力下降（P＜0.01）；细胞染色质凝聚与边集，衰老相关异染色质SAHF形成，高尔基体肿胀，线粒体水肿，溶酶体增加等。4.经ASP作用后，CD34+CD38－细胞群p16, Rb基因表达水平下降（P＜0.05）；下游调控蛋白P21和P16表达上调；CDK4和CyclinE表达水平下降；端粒酶活性下降（P＜0.05）；端粒长度缩短（P＜0.05）。5.移植LSCs细胞后，NOD/SCID小鼠表现为精神萎靡、体重较下降、腹部包块明显；外周血白细胞数量显著升高（P＜0.05）；骨髓增生活跃、肝脏有大量白血病细胞浸润；细胞免疫荧光检测提示小鼠骨髓细胞中有大量人源白血病细胞。6.给予ASP治疗后，白血病小鼠外周血白细胞数量较对照组显著下降；肝脏纹理较清晰，肝小叶结构明显，脾脏白血病浸润减少，提示白血病细胞在肝脏的浸润受到抑制；骨髓单个核细胞细胞衰老比例明显增加，集落形成能力下降；细胞增殖被阻滞在G0/G1期；P16和Rb蛋白表达上调、细胞周期调控蛋白CDK4和Cyclin D1表达水平上升。结论：1.免疫磁珠分选能获取纯度高、活性良好的CD34+CD38－LSCs。2. ASP在体外可有效诱导CD34+CD38－LSCs衰老。3. ASP诱导LSCs细胞衰老的机制可能与调控细胞端粒系统和p16-Rb信号通路有关。4.移植LSCs可成功复制NOD/SCID小鼠急性髓系白血病（AML）。5. APS可有效治疗白血病模型鼠的白血病症状，其机制与调控LSCs细胞衰老有关。