戊二酸（Glutaric Acid,Pentanedioic acid）又名1,3-丙二羧酸或胶酸,是一种重要的二元羧酸,广泛应用于塑料、化工和医药等领域。工业上主要从己二酸生产的副产物中回收戊二酸,但是该方法存在环境污染高、分离提纯困难和制备条件复杂等一系列问题,所以戊二酸的生物法合成得到了广泛关注。Zhao等通过在大肠杆菌中构建己二酸逆降解途径（RADP）实现了戊二酸的生物合成。通过使用浅蓝菌素抑制脂肪酸的合成提高丙二酰辅酶A的浓度,然而该方法戊二酸产量较低,无法满足工业生产需求,所以本课题在此基础上继续进行代谢工程改造和发酵优化,进一步提高戊二酸产量。经前期实现结果发现,大肠杆菌中丙二酰辅酶A的含量较低,限制了戊二酸产量的提高。为了解决这一问题,在大肠杆菌中引入三叶草根瘤菌中的丙二酸摄入途径,通过SDS-PAGE和RT-qPCR验证了目的蛋白的表达以及目标基因的转录,使大肠杆菌能够利用丙二酸生产戊二酸。结果表明,外加4 g·L^-1丙二酸时,工程菌株戊二酸产量和产率即分别提高2.1倍和10.7%。经过一系列丙二酸梯度优化后,戊二酸产量最高可提高2.7倍,达到0.56 g·L^-1。在此基础上研究发现引入丙二酸摄入途径使戊二酸产量提高增加了菌体内ATP含量,而丙二酸的吸收利用导致菌体量的增加进一步消耗ATP。为了弥补ATP的消耗,工程菌株产生大量的乙酸。为了增强戊二酸的合成途径及弱化竞争途径,在大肠杆菌中敲除延胡索酸酶基因（fumC）和琥珀酰辅酶A合成酶基因（sucC）。结果发现,敲除fumC后工程菌株戊二酸产量并没有显著提高,敲除sucC使后菌体生长和生产失衡甚至导致戊二酸不生产,表明通过以上敲除竞争途径和减少辅因子等方式并不能提高戊二酸产量。在以上研究基础上,对发酵过程进行优化。通过实验确定了发酵培养基初始糖浓度为8g·L^-1,使用0.8 mM IPTG在OD₆₀₀=2左右时诱导目的蛋白表达。在揺瓶优化的基础上进行扩大培养,确定了5 L发酵罐的发酵条件是0.5 vvm通气量和400 rpm的搅拌速度,此时戊二酸的产量为3 g·L^-1。在分批发酵中添加10.4 g·L^-1丙二酸时戊二酸的产量达到4.35 g·L^-1,产量提高了45%。确定了最优补料碳源甘油,为了使菌体更高效的利用甘油,选择使用溶氧作为参数控制补料速度,在菌体生长时,控制溶氧参数为0;当合成目标产物时,降低补料速度维持溶氧为50%,最终戊二酸产量达到了最高为6.3 g·L^-1,实现戊二酸产量的进一步提高。