病毒DNA整合进宿主DNA的过程是某些反转录病毒在宿主细胞中增殖的关键步骤。由于在正常人类细胞中不存在相似的功能蛋白，其抑制剂对人体的副作用可能很小。相对于经典AIDS治疗药物的众多毒副作用，整合酶抑制剂理论上要具有优势，因此成为受人瞩目的治疗艾滋病的新靶点。以重组HIV-1整合酶为目标蛋白，采用噬菌体展示技术，在随机线性七肽库中筛选与整合酶有特异结合作用的噬菌体展示肽，得到13个具有特异结合能力的阳性克隆；经DNA测序推断出七条氨基酸序列。选取同源性较高的TPSHSSR和HPERATL两条肽，它们可以竞争性地抑制展示相应肽段的噬菌体与整合酶的结合。通过体外整合酶活性实验显示，它们对整合酶的整合活性（3’加工和链转移过程）有抑制作用，TPSHSSR和HPERATL的半数抑制率即IC₅₀分别为54.56±5.18μM和28.292±1.32μM。同时，实验证明这两条多肽还有抑制去整合的作用。我们的研究表明：用噬菌体展示技术可以筛选到有效的HIV-1整合酶的抑制剂，可用于整合酶机理的研究，并有潜在的新药开发前景。1．HIV-1整合酶的表达与纯化及活性鉴定将转化有质粒PT7-7-His-TX-WT-IN的E.coli BL21（DE3）菌接种于含有Amp（终浓度为100μg／ml）LB培养基中培养，加IPTG诱导表达后6 000 rpm，4℃离心收集菌体。超声破碎后，15 000 rpm，4℃离心收集上清。上清经Ni—NTA柱分离纯化，得到较纯的整合酶。整合酶活性的鉴定分别检测了整合酶的整合与去整合两个作用。整合作用采用的是一种非放射性的类似于ELISA的方法，而去整合活性则是将整合酶与相应底物反应，经电泳分析底物的变化来定性鉴别。2．噬菌体肽库的筛选及阳性克隆的鉴定本实验筛选的肽库为随机线性七肽库。将纯化得到的具有活性的HIV-1整合酶蛋白包被在酶标板上，经5％BSA封闭，噬菌体的结合，酸洗脱、中和，测滴度、扩增等基本步骤的循环筛选后，噬菌体得到了富集，程度达到了700倍左右。将第五轮洗脱下来的噬菌体感染E.coli ER2738，挑取平板中的清晰菌斑，制备单克隆噬菌体溶液。在96孔板上包被整合酶蛋白，同时包被BSA作为阴性对照。经封闭后加入单克隆噬菌体溶液。洗涤各孔后加入辣根过氧化物酶标记的M13抗体，而后用TMB进行显色。比较各个克隆与整合酶和BSA的结合效果，筛选出特异结合整合酶蛋白而非BSA的阳性克隆。本实验筛选得到了13个阳性克隆。3．DNA测序及多肽序列的推断提取阳性克隆的单链DNA，送交上海生工进行测序，测序以—96通用引物（5’-GCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’）为引物。13个阳性克隆共得到7条序列。根据DNA测序结果，推测出这七条序列的氨基酸序列，分析他们之间的氨基酸组成特点。其中有两条多肽的前三个氨基酸一致，另两条多肽的第1、2和第4个氨基酸一致，并且七条肽序列中，大部分都含有组氨酸，精氨酸，脯氨酸和丝氨酸。4．合成七肽的竞争抑制ELISA实验两条合成的七肽与展示相应肽段的噬菌体竞争性地结合整合酶的能力反映了这两条肽的相对亲和力。在96孔免疫吸附板中包被整合酶蛋白，加入不同浓度的合成多肽及一定量展示相应肽序列的噬菌体溶液，使两者竞争结合整合酶。通过辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体结合，TMB显色后，计算出噬菌体结合率：结合率％=[1-(A₄₅₀-A’₄₅₀)／A₄₅₀]×100％；其中A₄₅₀为未加抑制剂时450nm波长下的吸光度，A’₄₅₀为加入抑制剂后450 nm波长下的吸光度。随着合成多肽浓度的增加，与整合酶结合的展示相应肽序列的噬菌体逐渐减少，结合率下降。这些结果充分证明了筛选出来的两条多肽与整合酶蛋白特异性结合的特点，亲和力较好。5．多肽对整合酶活性抑制实验针对整合酶的整合与去整合作用，用合成的多肽分别对这两个反应的抑制作用做了分析。实验方法与整合酶活性检测相似，只是整合酶需要和合成的多肽先进行预反应。实验发现合成的两条多肽TPSHSSR和HPERATL对整合酶的整合、去整合作用都有抑制作用。整合酶的去整合作用对整合酶的序列及结构完整性的要求不高，只要有核心结构域存在即可；而整合作用必须要求整合酶既有核心结构域，又有N末端和C末端结构域。所以，这两条多肽对整合酶的作用位点很可能就在核心结构域上。