植物DREB抗逆转录因子dsDNA芯片研究

来源 :中国科学院寒区旱区环境与工程研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhanglicg
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植物的抗胁迫(干旱、盐碱、寒冷)功能是多种基因控制的综合反应,过去的抗逆基因工程研究一直停留在某一个或几个基因上,对基因的表达、结构和与其相关基因调控机制缺乏详细的研究。一个植物抗逆转录因子(如DREB)可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐受性有关的功能基因的表达。双链DNA芯片(dsDNA,double strand DNA)能够非常有效地检测基因表达调控中序列特异性DNA(顺式作用元件)和蛋白质(转录因子)的相互作用,因此,本研究提出制备双链DNA微阵列芯片,从蛋白质编码基因的调节区着手,研究抗逆转录因子作用机理。   在本研究中,以拟南芥为材料,以干旱、盐碱、寒冷等逆境胁迫相关的AP2/EREBP家族的DREB子家族转录因子DREB1A、DREB2A为研究靶点,通过PCR和RT-RCR扩增得到抗逆转录因子DREB1A、DREB2A基因,将其分别克隆到PUCm-T载体中,序列分析表明获得的基因序列与已报道的该基因序列完全相同。将克隆的目的基因与表达载体PET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)和RosettaTM(DE3),DREB1A蛋白得到了成功表达,而DREB2A未表达。利用His-Tag纯化柱在AKTATM纯化仪对目的蛋白进行纯化,获得了DREB1A蛋白。   同时,对双链DNA芯片的制备方法做了初步的探讨。用Taq DNA聚合酶代替了价格昂贵的Klenow DNA聚合酶,并对Taq DNA聚合酶在片延伸体系的反应温度,Mg2+浓度以及单链探针的变性、不变性等条件进行了优化。发现利用Taq DNA聚合酶在片延伸制备双链DNA芯片时,延伸温度50℃效果较好,Mg2+浓度2.5mM效果明显好于1.5mM;单链不变性效果优于变性处理。优化方法制备的双链DNA芯片将更有利于DRE顺式作用元件与表达的DREB抗逆转录因子蛋白相互作用的研究。
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