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木霉菌(Trichoderma spp.)是一种应用前景广阔的植物病害生物防治菌,生防潜力巨大,被广泛应用于农业和林业。对其生防机制进行了深入的研究。木霉菌不仅能抑制病原真菌,还能直接作用于寄主植物,刺激寄主植物对病原真菌产生系统抗病性。棘孢木霉分泌的木聚糖酶属于糖基水解酶家族11(Glycosyl hydrolases family 11,GH11),能够刺激寄主植物对病原真菌产生系统抗病性,被称为新型植物诱导剂,具有很高的科研价值和广阔的开发前景。在本研究中,克隆获得棘孢木霉ACCC30536菌株的GH11家族中4个木聚糖酶基因(Xyn)。Xyn29.4有1个内含子,有282aa,等电点为5.51,蛋白分子量为29.4kDa;Xyn24.2有1个内含子,有223 aa,等电点为6.82,蛋白分子量为24.2kDa;Xyn24.4有1个内含子,有230 aa,等电点为5.00,蛋白分子量为24.4 kDa;Xyn24.1有2个内含子,有225 aa,等电点为5.25,蛋白分子量为24.1 kDa。基因结构方面,GH11家族的所有Xyn基因可以分成4类,分别为Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ类,每类中的Xyn基因成员其基因结构和保守域分布等特点都高度相似,而棘孢木霉GH11家族的4个Xyn基因Xyn29.4、Xyn24.2、Xyn24.4和Xyn24.1在这四类中均匀分布,各占一个分支。蛋白结构方面,Xyn29.4、Xyn24.4和Xyn24.1属于Ⅰ型内切-1,4-β-木聚糖酶;Xyn24.2属于Ⅱ型内切-1,4-β-木聚糖酶。本研究提供了一种处理木霉分生孢子的方法,处理后的木霉分生孢子更容易被提取RNA。用荧光定量RT-qPCR方法在棘孢木霉ACCC30536分生孢子与山新杨苗共培养条件下的棘孢木霉GH11家族的木聚糖酶Xyn基因的转录水平。在棘孢木霉分生孢子与山新杨苗共培养的诱导条件下,棘孢木霉菌株Xyn24.4和Xyn24.1基因在此种诱导条件下不表达。棘孢木霉菌株的Ⅰ型内切-1,4-β-木聚糖酶的基因(Xyn29.4基因)表达模式与Ⅱ型内切-1,4-β-木聚糖酶(Xyn24.2基因)的基因表达模式整体相似,它们的表达量都在12 h达到巅峰。在棘孢木霉菌株与山新杨苗互作过程中,棘孢木霉菌株GH11家族的Xyn29.4和Xyn24.2基因起重要作用。为研究棘孢木霉GH11家族的木聚糖酶Xyn的特性及诱导植物系统抗病性的机制,成功构建了蛋白表达载体pPIC9K-Xyn29.4和pPIC9K-Xyn24.2。成功构建了重组木聚糖酶酵母工程菌株GS115-Xyn29.4与GS115-Xyn24.2。重组木聚糖酶工程菌株GS115-Xyn29.4与GS115-Xyn24.2成功表达出木聚糖酶:29.4 kDa的Ⅰ型重组木聚糖酶rXyn29.4和24.2 kDa的Ⅱ型重组木聚糖酶rXyn24.2。酶活力最高分别为18.9 IU/mL和20.4IU/mL。为研究重组木聚糖酶对木本植物的诱导系统抗病性的机制,探讨了用重组木聚糖酶诱导的山新杨的基因转录模式和生理变化。(1)重组木聚糖酶诱导山新杨后,刺激了JAR1基因正调控,COI基因负调控,而JAZ的转录水平呈先上升后下降的表达规律,最终激活ORCA3的表达,重组木聚糖酶能够刺激山新杨的茉莉酸信号,从而山新杨建立诱导系统抗性(Induced systemic resistance,ISR),使山新杨对病原菌具有广谱抗性。(2)经过重组木聚糖酶诱导后山新杨的地上鲜重,干重,株高,叶长,叶宽,根长,根数各项指标比未经诱导的山新杨的各项指标显著升高。结合重组木聚糖酶能够控制山新杨生长素信号相关基因表达,最终激活GH3的表达,从而调节植物生长。因此可以得出结论,重组木聚糖酶能够促进山新杨生长。(3)重组木聚糖酶提高山新杨叶片的过氧化氢酶(Catalase,CAT)酶活性,从而降低H202的累积,与此同时降低丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,进一步提高山新杨的抗氧化能力。重组木聚糖酶诱导后的山新杨,Evans blus和nitroblue tetrazolium(NBT)染色实验中,叶片细胞坏死的部分较少,再次说明重组木聚糖酶提高山新杨防御酶活性,降低了活性氧的积累。为研究重组木聚糖酶对木本植物的诱导系统抗病性的机制,探讨了用重组木聚糖酶诱导的山新杨的抗病能力及抗病途径。在山新杨离体叶片实验中,重组木聚糖酶诱导后接种叶枯病病原链格孢菌的山新杨叶片的气孔形状以及打开程度健康叶片的气孔形状以及打开程度基本一致,山新杨叶片叶枯病病原链格孢菌发病面积较小和气孔形状以及打开程度说明重组木聚糖酶明显诱导了山新杨的系统抗病性,从而很好的防御叶枯病病原链格孢菌侵染。在山新杨整株接种立枯丝核菌和尖孢镰刀菌实验中,先重组木聚糖酶诱导然后立枯丝核菌和尖孢镰刀菌侵染的处理组的山新杨的地上整株没有明显发病迹象呈现自然状态,地下根部非常健康,重组木聚糖酶的预诱导能够激发山新杨对立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的抗病性。重组木聚糖酶诱导后,前期荧光定量数据表明,茉莉酸信号通路上调,而且在后期测量诱导后山新杨叶部茉莉酸的实验数据表明,重组木聚糖酶诱导后山新杨叶部茉莉酸含量随时间变化强度很大,尤其是12 h时,山新杨叶部茉莉酸含量竟达到对照组山新杨叶部茉莉酸含量的2.2倍,重组木聚糖酶能刺激山新杨茉莉酸含量先增高后降低。在重组木聚糖酶局部或系统诱导山新杨抗病性实验中,重组木聚糖酶在根部诱导能够起诱导山新杨系统抗病性的作用,而且,仅仅诱导山新杨局部根部,就能够诱导山新杨整株产生系统抗病性。山新杨叶部被喷上茉莉酸甲酯,进行诱导,然后左边根部被尖孢镰刀菌侵染的实验组中的山新杨没有出现明显的发病情况,重组木聚糖酶通过刺激山新杨产生更多的茉莉酸,进而诱导山新杨系统抗病性。综上所述,棘孢木霉ACCC30536菌株GH11家族的Ⅰ型木聚糖酶基因Xyn29.4和Ⅱ型木聚糖基因Xyn24.2的克隆、生物信息学分析及转录模式研究为诱导剂重组木聚糖酶的研究提供基础数据;木聚糖酶基因Xyn29.4和Xyn24.2真核表达和特性研究为新型植物诱导剂的开发与利用提供理论依据和技术支持;重组木聚糖酶rXyn29.4和rXyn24.2能够促进山新杨的生长,更重要的是能够局部根部诱导山新杨,通过茉莉酸途径诱导山新杨可以引起山新杨系统抗病性,为研究诱导剂重组木聚糖酶诱导植物系统抗病性机制奠定理论支持。