适应性进化的分子机制是适应性进化最本质的部分,是理解物种适应性进化的关键。在分子水平上,根据编码蛋白质基因的功能和含量是否发生变化,可将适应性进化分为:(1)基因序列水平和(2)基因表达调控水平两种。受到正选择的基因和基因表达量的变异介导了物种适应性表型的形成,对物种的适应性进化有着重要的贡献。基于新一代测序技术的转录组学是一种高效而精确的研究方法,为适应性进化提供了更为广阔的视野,通过转录组数据分析物种在基因序列水平和基因表达水平上的差异,可以很好得理解物种的适应性进化分子机制。干旱对植物生长发育、农林业生产以及生态环境都造成很大影响。植物耐旱的机制和策略千差万别,对植物耐干旱机制的研究已经从多角度多层面展开。近年来,荒漠植物耐旱机制的研究发展很快,但是主要集中于一些典型的荒漠植物比如红砂、沙冬青、白刺等上,而对干旱适应性很强的低矮草本植物的研究却相对较少,且对蚓果芥的研究完全空白。分别生长于青藏高原和西北干旱区的两种蚓果芥在表型上发生了明显的分化,并对这两种环境具有很强的适应性,所以它们是研究植物对高原和干旱区环境适应性分化和进化的良好材料。另外因其很强的耐旱,它们的耐旱机制也值得研究。本研究中,为了研究青海互助(HZ)和兰州白虎山(BSH)两种生态型蚓果芥适应性分化、进化的分子机制,我们结合两种生态型蚓果芥在控制条件下表型(种子发芽、生长发育)和染色体的差异,对两种生态型蚓果芥转录组结果进行组装,注释,分析两者的差异表达基因,筛选两者的适应性正选择基因;另外,为了研究耐旱性更强的HZ型蚓果芥的耐旱机制,我们对HZ型蚓果芥幼苗用PEG-6000溶液进行渗透胁迫处理,对其叶片各项生理指标进行测定,并对一个响应渗透胁迫的基因(BhCIPK12)进行克隆和表达分析,最后对一批与抗氧化相关基因的表达模式进行分析,以期从生理、分子层面对HZ型蚓果芥耐旱机制得以初步地探索。本研究得到以下主要结论:1.两种生态型蚓果芥表型和染色体的差异:(1)HZ型蚓果芥具有更强的种子活力;(2)BHS型蚓果芥生长发育较HZ快,HZ型蚓果芥未能在室内所控条件下抽薹;(3)BHS型蚓果芥为2倍体(n=14),HZ型蚓果芥为4倍体(n=28)。2.hz和bhs两种生态型蚓果芥转录组的测序、组装与注释:(1)hz和bsh型蚓果芥转录组测序分别获得大约22.4mb和21.6mb的干净reads。hz型共获得40,762个unigenes,平均长度为833bp;bhs型获得46,485个unigenes,平均长度为764bp。两种生态型总共获得72,833个不冗余基因,平均长度812bp;(2)蚓果芥与十字花科物种拟南芥、深山拟南芥和芥菜的相似度最高;大多数基因可获得注释且多数与响应环境或者激素诱导的生物学过程,比如响应盐胁迫和钙离子等有关,这些基因在正常生长发育阶段的高表达可能对蚓果芥适应各种逆境环境有很大帮助。3.两种生态型蚓果芥转录差异表达分析:(1)总共有7,499个unigenes在bhs和hz型中发生差异表达,其中大多数与响应环境胁迫有关,主要是响应盐胁迫、钙离子、冷胁迫、aba通路、脱水胁迫的基因,这些基因的差异表达可能是两种生态型蚓果芥产生分化的原因。(2)33个转录子家族中发现差异表达基因,其中,最多的4个家族分别是ap2/erf,bhlh,myb,和wrky家族,这些转录资家族基因可能在两种生态型分化过程中起着重要作用;(3)43个与开花相关的基因发生差异表达,18个与光周期、生物钟和光信号有关,8个与赤霉素信号通路和代谢有关,13个与春化和自主通路有关,4个与分生组织响应和发育有关,这些基因的差异表达可能与hz型不能在室内抽薹有直接关系。4.两种生态型蚓果芥适应性正选择基因分析:(1)共获得145个正选择基因,主要是与响应盐胁迫和寒冷胁迫有关的基因,这些基因对于蚓果芥适应逆境环境至关重要;(2)25个基因为正选择差异表达基因,其中包括两个与胁迫和荷尔蒙相关的基因ein2和keg以及一个调控开花时间相关的基因elf6,这些基因对两种蚓果芥适应各自环境至关重要。5.互助型蚓果芥对渗透胁迫的生理响应:(1)hz型蚓果芥对peg-6000的耐受极限在20%~30%之间,高于这个耐受极限,植物会在短期内严重失水并会受到严重氧化损伤;反之,水分和氧化损伤水平会在很长时间内保持相对稳定的水平;(2)可溶性蛋白含量结果表明,植株在胁迫后期仍然保持很高的活性,另外,可溶性蛋白可能在胁迫后期参与渗透调节活动;(3)sod和cat酶主要在胁迫早期对植株起保护作用,而pod在胁迫晚期,尤其在受到严重损伤的植株中作用更为突出。6.互助型蚓果芥响应渗透胁迫基因(BhCIPK12)的分离、克隆和表达分析:(1)在30%/4h的叶片材料中发现了长大约为1600 bp的差异表达片段。该片段的ORF序列为1060 bp,预测蛋白氨基酸490个,预测分子量54.99 kDa,pI为7.66;(2)我们推测BhCIPK12的表达模式为:随着叶片中水分的降低表达水平会先增加后减少,并且表达丰度的显著增加与叶片在短时间内水分的骤减有很大关系。7.互助型蚓果芥抗氧化相关基因响应渗透胁迫的表达分析:(1)59个目的基因中有35个基因表达上调,包括12个抗氧化物基因,12个信号基因和转录子基因,11个光合相关基因。23个基因表达下调,包括4个抗氧化基因,1个信号基因和18个光合作用相关基因;(2)大多数抗氧化物基因在早、中期的表达活跃可能在蚓果芥的抗氧化机制中起到重要作用;大量信号通路基因在胁迫早、中期的高表达对蚓果芥启动抗氧化等保护机制有重要作用;光合活动在胁迫过程中受到了严重抑制,GHLH,PPDK2以及PHYA,B等少数光合基因可能在胁迫过程中,对维护蚓果芥光合活动有重要作用。