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基质金属蛋白酶（MMPs）是一类锌离子依赖的肽链内切酶，能够降解多种细胞外基质组分及多种生物活性分子如趋化因子、生长因子等，与肿瘤等多种疾病相关。膜I型基质金属蛋白酶（MMP-14，MT1-MMP）是第一个被发现的膜型基质金属蛋白酶。MMP-14在几乎所有的肿瘤细胞中高表达，能够定位到细胞表面，并能够通过內吞的机制循环回到细胞中，在多种疾病尤其是肿瘤的发生生长、侵袭、转移和血管生成具有重要作用。这使得以MMP-14为靶点，开发出能够高度特异性亲和MMP-14的配体或者抑制剂具有重要意义。其中，MMP-14亲和多肽作为MMP-14抑制剂或者在以MMP-14为靶点的肿瘤成像探针中具有重要的应用价值。MMP-14的MT-loop区是MMP14催化结构域（cdMMP-14）中的一段同源性非常低的氨基酸序列，位于整个蛋白分子的表面，是一个非常好的特异性靶点。并且它的突变对MMP-14的底物活性和构象没有太大的影响。基于以上理论，本论文意在通过对MMP-14的MT-loop区进行突变，筛选出有活性的cdMMP-14突变体，并根据突变体和野生型cdMMP-14（WT-cdMMP-14）在MT-loop区结构上的差异，相继以它们为靶分子，采用噬菌体展示技术，筛选出能够特异性靶向具有天然构象的MT-loop区的亲和多肽。为新的MMP-14高特异性亲和多肽的进一步应用做准备工作。首先，我们利用重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR）技术对MMP-14的MT-loop区进行了突变，其中一个突变是把MT-loop序列“163PYAYIREG170”完全删除，得到D-cdMMP-14突变基因，另外的两个突变体分别是对序列“160REVPYAYIRE GHEKQ174”进行随机乱序得到另外两个随机序列“160EPRQHEYARI EVKYG174”和“160IPEKQAEYVG ERRYH174”，代替原来的序列后得到L1-cdMMP-14和L2-cdMMP-14突变基因。随后，我们将这三个突变基因以及WT-cdMMP-14基因构建到pET21（a+）表达载体中，以BL21（DE3）为表达菌，以包涵体的形式对重组蛋白进行表达、纯化、复性和活性检测。结果D-cdMMP-14-His6和WT-cdMMP-14-His6具有相近DQ-gelatin底物活性和明胶酶谱活性。计算机模拟结果显示D-cdMMP-14-His6和WT-cdMMP-14-His6的三维结构差异只出现在了MT-loop区处。接着，我们根据D-cdMMP-14-His6和WT-cdMMP-14-His6的结构差异设计实验方案进行噬菌体展示肽库的筛选。总的原则是先用D-cdMMP-14-His6为靶分子将能够和其结合的噬菌体除去，再将没有结合的噬菌体和WT-cdMMP-14-His6孵育结合。最后从筛选结果中取30个噬菌体单克隆，利用ELISA技术鉴定各噬菌体（展示的多肽，下同）是否只对WT-cdMMP-14-His6具有结合活性，如果是，那么可断定噬菌体是结合到了MT-loop区上。因为D-cdMMP-14-His6没有MT-loop区，如果噬菌体对其表现出结合活性则说明噬菌体不是结合到MT-loop区上。但是其中并没有只对WT-cdMMP-14-His6表现出结合活性的噬菌体。综上，本研究中，我们对cdMMP-14的MT-loop区进行了突变，对重组子进行表达复性之后获得了有活性的突变体——D-cdMMP-14，且计算机结构模拟显示，D-cdMMP-14和WT-cdMMP-14在结构上的差异只出现在了MT-loop区。在此基础上，我们进行了噬菌体十二肽展示文库的筛选，得到了能够靶向WT-cdMMP-14的噬菌体，但靶点并不在MT-loop区。