家蚕促咽侧体素受体鉴定及相关神经肽受体基因的发育表达

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昆虫神经肽及其G蛋白偶联受体(GPCR)在调控其生长、发育、生殖、神经传导、代谢以及行为等方面起重要的作用,是绿色农药设计重要的靶基因。促咽侧体素是家蚕重要神经肽,其主要的生理功能是促进保幼激素的合成和分泌,加速心脏搏动,抑制活性离子运输等。把昆虫促咽侧体素的受体作为靶基因研究高活性的昆虫生长调节剂具有重要的意义。本文克隆并鉴定了家蚕神经肽促咽侧体素的G蛋白偶联受体基因(Allatotropin receptor,Bom-ATR),调查其发育变化;然后系统地研究了家蚕其他16种相关的神经肽受体基因的发育表达模式。家蚕促咽侧体素受体基因开放阅读框全长为1254bp,编码416个氨基酸。Bom-ATR氨基酸序列的二级结构预测为7次穿膜蛋白,符合GPCR家族成员的典型特征。预测家蚕ATR的3-D结构结果表明其包含18个螺旋,其中主要的α-螺旋有7个,与7次跨膜结构一致。家蚕的ATR与烟草天蛾的ATR关系最接近,其次为家蚕神经肽受体BNGR-5,家蚕的ATR与埃及伊蚊、小金蜂、赤拟谷盗的ATR距离较远,这与传统的系统关系一致。把Bom-ATR的ORF插入到pcDNA5-FRT质粒中,构建pcDNA5-FRT-Bom-ATR-ORF重组质粒,转染HEK细胞株,与家蚕AT结合分析表明,AT与Bom-ATR结合Ca2+产生明显的应答,Ca2+的响应曲线呈现出剂量依赖型,AT与Bom-ATR作用的EC50值为2.16nM,证明我们克隆的Bom-ATR是AT的G蛋白偶联受体。实时荧光定量PCR结果表明,家蚕脑-咽下神经节复合体中的ATR mRNA在5龄幼虫期表达量最高,其次为蛹后期,蛹前期和成虫阶段表达量最低。其中5龄幼虫第2天表达量最高,5龄1-5天持续维持较高的表达水平,这可能与保幼激素的合成有关。调查了其他15种神经肽G蛋白偶联受体基因在家蚕脑-咽下神经节复合体中的发育表达模式,不同神经肽G蛋白偶联受体基因发育表达模式明显有差别。所调查的16种神经肽基因中,sNPF1等7个受体基因在5龄前期表达量高,预蛹期高表达的受体有sNPF2受体、Tachykinin2受体、CAPA1和Sulfakinin受体,在成虫期仅Tachykinin2受体和BNGR-2保持较高的表达量,其他神经肽受体基因表达量相对较低。
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