目的:随着环境污染、劳累、精神心理因素的影响,患癌人群趋向于年轻化。年轻女性因化疗出现早发性卵巢功能不全（Premature ovarian insufficiency,POI）的病例屡见不鲜,目前仍缺乏有效的治疗方式。研究数据表明,线粒体功能下降可能与化疗后POI相关,但目前尚无使用游离线粒体静脉注射治疗化疗后POI的报道。本研究从动物及细胞层面,进一步验证线粒体功能下降与化疗后POI相关性,探索使用静脉注射的方法移植游离线粒体改善化疗后POI的作用,并初步探讨了疾病与线粒体凋亡通路关键分子表达水平之间的关系。以期为今后POI的有效治疗提供实验室应用奠定基础。方法:1.游离线粒体的提取及功能鉴定:提取成年C57BL/6小鼠肝脏线粒体,通过共聚焦激光扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope,Confocal）、透射电子显微镜鉴定所提物质为游离线粒体,JC-1流式细胞仪及倒置荧光显微镜检测评估游离线粒体的活性。2.POI小鼠模型的制备:将24只6-8周成年C57BL/6雌鼠随机分为四组,分别为低剂量环磷酰胺（Cyclophosphamide,CTX）连续注射14天组（CTX（10））、低剂量CTX联合白消安（Busulfan,BUS）单次注射组（CTX（30）+BUS（8））、高剂量CTX联合BUS单次注射组（CTX（60）+BUS（15））和空白组（Blank）。造模后通过小鼠一般情况、阴道涂片、卵巢组织HE染色、血浆性激素雌二醇（Estradiol,E2）、卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone,FSH）及抗缪勒管激素AMH水平的检测评估造模方案,筛选较优方案进行下一步实验。其中,小鼠处死前2天皮下注射孕马血清促性腺激素（Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSG）0.1mL/只,以避免雌鼠处于不同发情周期造成结果误差;处死前12小时禁食禁水。3.游离线粒体尾静脉注射改善POI的动物实验研究:使用CTX（60）+BUS（15）造模方案制备POI动物模型,游离线粒体200 μg/只经尾静脉注射至小鼠模型体内,分别进行游离线粒体器官定位、卵巢功能及全身脏器变化的研究。3.1游离线粒体器官定位:随机将POI动物模型12只分为四组,分别为染色线粒体注射后2小时组（Mito 2h）、12小时组（Mito 12h）、24小时组（Mito 24h）和造模组（Control）。于相应时间点切除小鼠卵巢、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏制备冰冻切片,使用Confocal观察游离线粒体分布情况。3.2卵巢功能及全身脏器的变化:随机将POI动物模型30只分为六组,分别为溶剂对照组（Saline）、POI模型组（POI）、空白+线粒体注射组（Blank+Mito）、溶剂+线粒体注射组（Saline+Mito）、POI+线粒体注射组（POI+Mito）、空白对照组（Blank）。经尾静脉注射游离线粒体后,每日监测小鼠阴道涂片、体重、饮食、活动及皮毛变化情况。游离线粒体注射后第14天处死小鼠,处死前2天皮下注射PMSG 0.1mL/只,处死前12小时禁食禁水。取出小鼠血清及卵巢组织进行血浆性激素E2、FSH及抗缪勒管激素AMH水平的检测,卵巢组织HE染色评估不同组别各级卵泡数量之间的差别、IHC及Western blot检测经典凋亡通路关键蛋白Bcl-2、Bax的表达水平。3.3取出小鼠子宫、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏进行HE染色了解静脉注射游离线粒体是否对全身重要器官产生影响。4.线粒体移植改善POI的分子机制探讨:使用CTX的代谢活性产物磷酰胺芥末（phosphamide mustard,PM）降低卵巢细胞的线粒体功能,模拟POI疾病卵巢细胞的状态,将游离线粒体与细胞模型共孵育后检测结晶紫、CCK8、细胞氧耗率、ATP、细胞凋亡实验及线粒体凋亡通路关键蛋白的表达水平,初步探讨线粒体移植改善POI的分子机制。Mito-Tracker Red染色游离线粒体后与CH0细胞模型及GCs细胞模型共孵育,通过Confocal显微镜检测游离线粒体是否进入细胞。为验证游离线粒体与小鼠卵巢颗粒细胞（Granulosa cells,GCs）模型共孵育后是否可以进入细胞膜,使用小鼠GCs重复这个关键实验。结果:1.游离线粒体的提取及功能鉴定:Confocal下可见Mitotracker标记的红色荧光,电镜下见所提取的游离线粒体内部结构清晰,形态包膜完整。流式细胞仪可见CCCP+游离线粒体组绿色荧光强度明显高于红色荧光,游离线粒体组红色荧光强度高于绿色荧光。2.POI小鼠模型的制备:CTX（10）组、CTX（60）+BUS（15）组及CTX（30）+BUS（8）组制备的POI模型小鼠在造模后一周均出现正常发情周期占比、卵巢直径、血清AMH水平降低;其中CTX（60）+BUS（15）组卵巢组织切片HE染色结果优于其它组别。3.游离线粒体尾静脉注射改善POI的动物实验研究:3.1游离线粒体经尾静脉注射后2小时可到达卵巢组织,12小时仍定位于卵巢组织中,注射后24h线粒体数量明显减少;尾静脉注射仅2小时内有部分线粒体定位于肾脏和肝脏。3.2与POI+buffer组相比,POI+Mito组正常发情周期占比、卵巢直径、卵巢器官系数、E2水平、AMH水平及卵巢原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡数量明显上升,FSH水平及卵巢闭锁卵泡数量较造模组明显下降。3.3 POI+Mito组GCs高表达Bcl-2,POI+buffer组的Bcl-2阳性信号明显减弱;免疫组化定量分析结果提示POI+Mito组Bcl-2/Bax较造模组明显上升,差异有统计学意义。Western Blot结果同免疫组化结果相一致。3.4游离线粒体体内移植不会引起全身重要脏器包括子宫、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏的组织病理学改变。4.线粒体移植改善POI的分子机制探讨:游离线粒体与CHO及GCs细胞模型共孵育后可进入细胞内部。游离线粒体可提高细胞模型的增殖能力、线粒体功能及ATP水平,减少细胞凋亡,增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平,降低促凋亡蛋白PARP-1、P53、cleaved Caspase-3的表达。结论:1.本实验使用差速离心法从小鼠肝脏成功提取结构完整、有活性的游离线粒体。2.使用CTX（60）+BUS（15）方案可成功制备POI动物模型。3.经尾静脉注射游离线粒体可进入卵巢,且定位于卵巢部位的线粒体数量最多。线粒体移植可恢复POI动物模型的卵巢功能,增加GCs Bcl-2/Bax的表达水平。经尾静脉注射线粒体移植不会引起全身重要脏器的组织病理学改变。4.游离线粒体与细胞模型共孵育后可进入细胞内部。线粒体移植可提高细胞模型Bcl-2表达水平,降低促凋亡蛋白表达水平,恢复卵巢细胞模型的细胞增殖能力,提高其线粒体功能、ATP水平,减少细胞凋亡。