论文部分内容阅读
本研究以菜籽为原料,经预处理、提取、分离和纯化得到均一菜籽多糖RPM1-a,采用单糖组成分析、甲基化分析和核磁共振技术对其一级结构进行解析,并研究了RPM1-a的流变性质;对RPM1-a分别进行硫酸化修饰、乙酰化修饰和羧甲基化修饰,评价了RPM1-a及其修饰产物的体外抗氧化活性以及对肠道益生菌体外增殖活性的影响。主要研究内容及结果如下:1.菜籽多糖的提取、分离和纯化。菜籽经过脱壳、粉碎、去油脂、除色素等预处理后,用氢氧化钠溶液浸提,然后通过脱蛋白、浓缩、醇沉、离心、冷冻干燥得到菜籽粗多糖。分别以去离子水和0.10 mol/L NaCl溶液为洗脱液,将粗多糖通过DEAE-Bestarose柱层析分离,收集由去离子水洗脱的组分,经过透析和冷冻干燥后,再用Chromdex-200层析柱进一步纯化,最后得到多糖组分RPM1-a。2.菜籽多糖一级结构的解析。红外光谱分析表明,RPM1-a具有多糖的特征吸收峰,为多糖类物质;高效液相色谱分析表明,RPM1-a为相对均一的多糖组分,相对分子量约为15.96 kDa。由气相色谱分析的结果可知,RPM1-a由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成,各单糖的摩尔比为3.70:47.00:21.30:27.90。综合甲基化分析和核磁共振波谱分析的结果可以推断,RPM1-a的主链由→6)-β-Galp-（1→、→3,4）-α-Rhap-（1→和→4）-α-Glcp-(1→构成,其O-3、O-4位被支链取代;主要支链和次要支链分别由β-Araf-（1→（5-β-Araf-1）16→（3-β-Araf-1）13→3）-β-Galp-(1→和β-Galp-（1→4）-β-Galp-(1→构成。其中,主要支链取代在O-3位,次要支链取代在O-4位。3.菜籽多糖的流变性质。采用流变仪研究了外界条件的改变对菜籽多糖黏度的影响。结果显示,菜籽多糖RPM1-a溶液黏度随其浓度的增加而增大,随温度和剪切速率的增大而减小;浓度对溶液黏度的影响较显著,稳态剪切条件下高浓度RPM1-a溶液（10%,m:v）为典型的假塑性非牛顿流体。pH对RPM1-a溶液的黏度影响较显著,在pH 59,溶液黏度随pH增大而增大;但当pH大于9时,溶液黏度呈降低趋势。Ca2+对RPM1-a黏度的变化的影响较为显著,且随着Ca2+浓度的增大,溶液黏度呈上升趋势。4.菜籽多糖的化学修饰。菜籽多糖RPM1-a经硫酸化、乙酰化和羧甲基化修饰,分别得到相应产物:SRPM1-a、Ac RPM1-a和CRPM1-a。红外光谱分析显示,SRPM1-a在1250 cm-1附近有不对称S=O键伸缩振动引起的吸收峰,830cm-1左右有C-O-S拉伸振动引起的吸收峰,588 cm-1附近有硫酸根基团O-S-O的对称变形引起的吸收峰;Ac RPM1-a 1735 cm-1附近的吸收峰由-COCR中的C=O不对称伸缩振动引起,1373 cm-1左右有H-C=O引起的吸收峰,1247 cm-1附近有C-O引起的吸收峰;CRPM1-a 1635 cm-1处吸收峰消失,而在1596、1421和1324 cm-1处出现由C=O、C-O和COO-引起的吸收峰。以上结果表明,硫酸化、乙酰化和羧甲基化修饰成功。5.构建超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH·自由基和Fe2+诱发的油脂过氧化等抗氧化体系,探索硫酸化修饰产物（SRPM1-a）、乙酰化修饰产物（Ac RPM1-a）和羧甲基化修饰产物（CRPM1-a）的抗氧化性,并与未经修饰的菜籽多糖（RPM1-a）的抗氧化性进行比较。结果表明,RPM1-a经硫酸化修饰后,体外抗氧化活性得到一定的增强;硫酸化产物SRPM1-a对超氧阴离子自由基和DPPH·自由基的清除作用,以及Fe2+诱发的油脂过氧化抑制作用均优于其他三种多糖。在乙酰化和羧甲基化修饰产物中,体外抗氧化活性未见显著增强;乙酰化产物的抗氧化活性低于未经修饰的菜籽多糖。这说明化学基团的引入可能会改变多糖的抗氧化活性,但不同的化学基团产生的影响有所不同。6.菜籽多糖化学修饰前后对肠道益生菌的体外增殖作用研究。通过体外培养的方法,以培养基的OD值和p H值为评价指标,研究了菜籽多糖RPM1-a及其化学修饰产物SRPM1-a、Ac RPM1-a和CRPM1-a对嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌和两歧双歧杆菌的增殖作用。结果表明,菜籽多糖RPM1-a及其修饰产物SRPM1-a、Ac RPM1-a和CRPM1-a对四种菌株均有一定的增殖促进作用,其中,SRPM1-a较RPM1-a的增殖效果更为明显。四种多糖对益生菌增殖作用的最佳浓度为1.5%2.0%;超过此范围,益生菌数量不再增加,或呈下降趋势。在体外培养过程中,培养基的p H值随益生菌数目的增加而相应降低,说明RPM1-a、SRPM1-a、Ac RPM1-a和CRPM1-a均可被益生菌利用,产生有机酸类物质。其中,添加SRPM1-a和Ac RPM1-a的培养基p H降低更加明显。益生菌生长速率的研究表明,益生菌在添加菜籽多糖RPM1-a的培养基中培养32 h达到稳定期,而在添加SRPM1-a和Ac RPM1-a的培养基中24 h即可达到稳定期。菜籽多糖RPM1-a的硫酸化和乙酰化修饰产物比未经修饰的菜籽多糖更容易被益生菌所利用,对益生菌的增殖效果更为明显,益生元效应得到提升。