研究目的：　　本课题通过建立化疗痛模型，先检测化疗痛大鼠背根神经节的Kcnk1基因甲基化水平的变化，来验证化疗痛与Kcnk1基因甲基化、去甲基化水平变化的关系;再通过背根神经节微注射HSV-TET1过表达TET1，检测过表达TET1是否能够反转这种变化，进而来验证过表达的TET1对化疗痛背根神经节内Kcnk1基因的甲基化影响。深入研究TET1与表观遗传修饰DNA甲基化之间的关系，有望揭示化疗痛的病理生理发生机制，为临床治疗化疗痛提供具有参考价值的新路径。　　研究方法：　　1.建立化疗痛模型　　选用SD雄性大鼠并分为Vehicle组和紫杉醇(Paclitaxel，Pac)组（每组≥5只）;Pac组每隔一天腹腔注射（第0、2、4、6天）化疗药物紫杉醇;Vehicle组腹腔注射对照溶液，注射方法与Pac组相同。　　2.观察化疗痛模型大鼠的行为学变化　　化疗痛模型建立后，Vehicle组和Pac组分别在第4、7、10天进行观察大鼠诱发痛行为，分别记录两组大鼠对机械刺激、热刺激以及冷刺激的行为学反应变化，并对记录进行统计分析。　　3.采用免疫荧光双标定位的实验方法观察钾离子通道K2p1.1在背根神经节内的不同的细胞之间的表达共定位　　建立大鼠化疗痛模型，取化疗痛模型大鼠L4-5背根神经节组织。本研究对所取的背根神经节组织，采用免疫荧光双标定位方法，检测K2p1.1在背根神经节内的神经元细胞与其他细胞的表达分布。　　4.化疗痛大鼠模型背根神经节显微注射HSV-TET1，并分别观察大鼠行为学变化　　对化疗痛模型大鼠背根神经节微注射HSV-TET1分为两种方式:第一种（诱导期）是化疗痛模型建立第4天背根神经节微注射HSV-TET1，分为Naive组、Pac+HSV+TET1组、Vehicle+HSV+TET1组、Pac+PBS组、Pac+HSV+EGFP组，分别观察各组对机械、热和冷刺激的行为学变化，并对各组记录进行统计分析。第二种（维持期）是化疗痛大鼠模型建立后第7天在大鼠的背根神经节行显微注射HSV-TET1，分为Naive组、Pac+HSV+TET1组、Pac+HSV+EGFP组，分别观察其各组对机械、热和冷刺激的行为学变化，并对各组记录进行统计分析。　　5.化疗痛大鼠模型的背根神经节神经元内的钾离子通道K2p1.1表达的变化　　建立大鼠化疗痛模型，取化疗痛模型大鼠L4-5背根神经节组织，对组织采用Western blot实验技术，检测在不同的时间点L4-5背根神经节神经元内钾离子通道K2p1.1表达的变化;取化疗痛模型大鼠L4-5背根神经节组织，采用免疫荧光双标染色技术，检测K2p1.1表达改变以及在不同细胞之间表达定位;化疗痛模型大鼠L4-5背根神经节显微注射HSV-TET1，观察化疗痛模型大鼠的L4-5背根神经节过表达TET1后，观察TET1的过表达对化疗痛模型大鼠的行为学反应的影响，对实验结果进行统计学分析。　　6.化疗痛模型的大鼠背根神经节显微注射HSV-TET1后，检测过表达TET1对大鼠背根神经节DNA甲基化水平的变化以及对K2P1.1通道蛋白表达变化的影响　　构建单纯疱疹病毒HSV-TET1过表达载体。在建立化疗痛大鼠模型后第4天和第7天，分别给予化疗痛大鼠模型L4-5背根神经节显微注射HSV-TET1，按照预期时间，分别取化疗痛模型大鼠的L4-5背根神经节组织显微注射HSV-TET1的背根神经节组织，然后对各组背根神经节组织，采用Western blot技术，检测在不同的时间点的背根神经节组织神经元内钾离子通道基因Kcnk1的表达变化;取各组背根神经节组织，使用免疫荧光双标技术，观察TET1和Kcnk1在背根神经节内的细胞共定位，观察背根神经节过表达TET1与钾离子通道K2p1.1的蛋白表达改变的关系。　　7.化疗痛模型的大鼠背根神经节显微注射HSV-TET1后，验证过表达TET1是否通过调控Kcnk1基因甲基化来参与化疗痛　　建立大鼠化疗痛模型背根神经节显微注射HSV-TET1后，取过表达TET1的化疗痛模型大鼠背根神经节组织，利用Western blot技术，检测化疗痛模型大鼠背根神经节内过表达TET1与Kcnk1基因启动子之间的关联性;取过表达TET1的背根神经节组织，利用染色体免疫共沉淀法(Chromatin immunoprecipitation assay ChIP)-PCR的方法，观察化疗痛模型大鼠背根神经节神经元内钾离子通道基因Kcnk1启动子区的甲基化水平的改变，验证Kcnk1基因启动子区5-mC以及5-hmC的变化。　　研究结果：　　1.大鼠Vehicle组和Pac组在给化疗药物前所测左右侧后足的基础阈值（机械刺激缩足反射阈值、热潜伏缩足阈值和冷刺激缩足反射阈值）均无明显差异(P＞0.05)。本课题实验分别检测Vehicle组和Pac组大鼠的左右侧后足的平均值进行统计学分析提示，Pac组的大鼠在建立后的第4、7、10天分别观察大鼠的行为学反应改变，与Vehicle组进行对比，发现Pac组的大鼠的机械刺激缩足反射阈值明显较低(P＜0.05)、热潜伏缩足阈值显著降低(P＜0.05)、冷刺激缩足反射阈值的次数明显增加(P＜0.05)。　　2.Pac组的大鼠在给予化疗药物后，取背根神经节组织，行Western blot分子实验技术，结果提示，Pac组与Vehicle组相比，Pac组大鼠的背根神经节内的钾离子通道K2p1.1的蛋白和mRNA的表达均显著降低。　　3.背根神经节不同的亚群标志物与钾离子通道K2p1.1行免疫双标染色实验技术发现，K2p1.1阳性细胞中49.1％为NF200（中、大直径有髓纤维神经元标志物）阳性，14.1％为CGRP阳性（中、小直径多肽能神经元），25.4％为IB4阳性（小直径非多肽能神经元）。利用免疫双标染色的实验技术检测K2p1.1在背根神经节内的细胞分布发现，K2p1.1与GS（谷氨酰胺合成酶，卫星胶质细胞标志物）几乎没有共表达，这些结果提示，在背根神经节内钾离子通道K2p1.1的蛋白主要在神经元细胞内表达。　　4.化疗痛模型的大鼠的背根神经节显微注射HSV-TET1，分别观察大鼠的行为学变化，研究结果发现，化疗痛模型的大鼠过表达TET1后，其机械刺激缩足反射阈值、热潜伏缩足阈值和冷刺激缩足反射阈值均发现有显著差异(P＜0.05)。这些结果均提示，化疗痛模型的大鼠的背根神经节显微注射HSV-TET1后过表达TET1，可阻断化疗药物诱导大鼠神经病理性疼痛行为学反应。　　5.化疗痛模型的大鼠的背根神经节显微注射HSV-TET1后过表达TET1发现，过表达TET1可调控化疗痛大鼠背根神经节DNA甲基化水平降低，而过表达TET1可诱发化疗痛的大鼠的背根神经节钾离子通道K2P1.1蛋白的表达升高。　　6.染色体免疫共沉淀-PCR实验，发现在化疗痛大鼠背根神经节Kcnk1基因启动子的R1和R3区，5-mC和5-hmC存在相反的变化，表明化疗痛大鼠背根神经节Kcnk1基因内5-mC表达升高而5-hmC降低，因此，可证实，化疗痛大鼠的背根神经节Kcnk1基因的甲基化水平升高;化疗痛大鼠背根神经节显微注射TET1过表达TET1，结果提示，背根神经节过表达TET1能够减少Kcnk1基因的甲基化水平。　　7.化疗痛模型大鼠显微HSV-TET1过表达TET1后，取大鼠背根神经节行Westion Blot技术，检测显示，化疗痛并没有改变TET1的表达，但却下调了Kcnk1基因的表达;但是，背根神经节内TET1过表达能够反转化疗痛模型背根神经节K2p1.1蛋白表达的下降，TET1的过表达和K2p1.1蛋白表达反向变化，提示TET1过表达能够上调K2p1.1蛋白表达。　　研究结论：　　化疗痛模型大鼠的行为学变化数据表明，大鼠的背根神经节显微注射HSV-TET1过表达TET1，能够缓解腹腔注射化疗药物紫杉醇诱导的化疗痛，而且背根神经节内的神经元的钾离子通道K2p1.1蛋白的表达也会相应降低，进而引起神经元兴奋性的增加，可能是参与化疗痛发病的分子机制;钾离子通道K2p1.1蛋白的表达降低可能是由于背根神经节Kcnk1基因启动子区域的甲基化水平的增加。TET1可诱导Kcnk1基因启动子区5-mC氧化生成5-hmC，可使Kcnk1基因的去甲基化水平升高，但降低了Kcnk1基因的甲基化水平。化疗痛并没有改变背根神经节内TET1的表达，但下调了K2p1.1蛋白表达。然而，化疗痛模型背根神经节显微注射HSV-TET1后TET1过表达，可上调钾离子通道K2p1.1蛋白的表达，并缓解大鼠的化疗痛行为。因此，TET1可能是参与化疗痛的发生与发展的非常重要的因素，本课题研究TET1与化疗痛的相互联系，或许对全面阐述表观遗传修饰的发生机制有帮助，为揭秘化疗痛的分子机理提供有意义的参考，为临床治疗化疗痛开辟新的思路。简而言之，背根神经节TET1过表达调控背根神经节DNA甲基化与去甲基化水平变化的机制，可能是预防和治疗化疗痛的潜在靶点。