小麦白粉病是影响小麦生产的重要病害之一,培育抗病品种是防控小麦白粉病的经济有效且环保的措施。挖掘和利用抗白粉病基因、解析小麦白粉病抗性的分子机制是白粉病抗性改良的重要基础。液泡加工酶（Vacuolar processing enzyme,VPE）基因家族在植物生长发育和抗病抗逆等生物学过程中发挥重要作用,小麦中存在多个VPE基因,但该家族基因在小麦族不同物种中的数量、分布和进化特征、基因和蛋白质结构特征及其生物学功能尚不清楚。簇毛麦（Haynaldia villosa L.）高抗白粉病,簇毛麦的VPE基因家族及其与抗白粉病的关系也不明了。本研究利用生物信息学方法,在禾本科植物（小麦族植物、稻属植物和黍亚科的玉米、高粱、谷子）中全基因组范围内鉴定VPE家族基因,并比较其在麦类植物的染色体分布、基因和蛋白质结构以及表达特征,鉴定和分析簇毛麦基因组中的VPE基因家族,选择克隆其中一个可能与白粉病抗性有关的成员VPE3-V,并研究其在抗白粉病中的功能,以期为进一步研究液泡加工酶基因家族的功能和作用机制奠定基础。节节麦（Aegilops tauschii）是小麦D基因组的供体种,具有抗病、抗逆等优异性状。近年来,节节麦基因组精细图谱的发布,为节节麦新基因的挖掘奠定了坚实基础。本实验室前期研究发现节节麦品系20021-02表现高抗白粉病,通过与感病品系20021-11杂交构建了 F2遗传作图群体。本研究在此基础上,结合55K SNP芯片扫描和目标区域连锁图谱构建,对抗性位点进行了分子标记定位,为进一步克隆抗性基因奠定了基础。本研究取得的主要结果如下:1、禾本科植物中VPE基因家族的鉴定与麦类植物中VPE家族基因染色体定位在14种禾本科植物中共鉴定到VPE家族基因127个,将其分为VPE1、VPE2、VPE3、VPE4.VPE5等五种类型。研究发现,同一族属植物VPE基因相似性更高。稻属和黍亚科的二倍体物种中大部分VPE基因是单拷贝,小麦族植物出现了基因复制现象。染色体定位分析表明,麦类植物VPE家族基因主要分布在第一、二、三、五、六部分同源群,不同物种间具有较好的共线性关系。VPE1、VPE5类型基因的数目和分布在不同物种中十分保守;VPE4类型基因在D基因组上出现了新的拷贝（6D）,该拷贝的出现在六倍体小麦的形成之前;VPE2类型基因在六倍体小麦形成过程中发生了多次基因复制,表现为串联分布特征;VPE3类型基因位于第三部分同源群染色体长臂端部和近着丝粒区域,在六倍体小麦形成时位于端部的基因发生了复制。2、普通小麦VPE家族基因的蛋白结构、表达特征和启动子特征分析序列比较分析发现,小麦中所有的VPE基因都含有内含子,同一类型的VPE基因其结构更加相似,直系同源基因的结构基本一致,旁系同源基因则存在内含子数目和长度的差异。VPE蛋白在进化过程中十分保守,所有成员都含有保守的功能结构域Peptidase C13。小麦不同VPE家族成员表达出现分化。VPE1和VPE2基因主要在种子中表达,而VPE3基因主要在茎叶中表达;分别受条锈菌、白粉菌和PAMP（chitin和flg22）诱导后,只有VPE3基因（TraesCS3B02G233000）表现下调表达的趋势;VPE4基因受小麦茎基腐病原菌（Fusarium pseudograminearum）诱导后下调表达;在不同非生物逆境诱导下,VPE3（TraesCS3B02G233000）表达出现变化。对不同VPE的启动子元件分析发现,VPE2、VPE1、VPE3、VPE5的启动子区域类似,均包含STRE、ABRE、ABRE3/4a、CGTCC-logo、CGTGG-logo、TATA-box、G-box 等元件,而 VPE4启动子区域差异较大,包含 AAGTG-logo、GGATC-logo、CAAT-box、Sp1、ABRE3a/4等元件;相比于其它类型基因,VPE1启动子元件分布更加紧密,且A、B、D亚基因组间的相似性较高。3、簇毛麦VPE基因家族的鉴定与VPE3-V的克隆和功能验证根据实验室获得的簇毛麦基因组和转录组数据,在簇毛麦中鉴定到12个VPE家族基因,其中VPE1和VPE4只有一个成员,VPE5有两个成员,其成员数目与其它麦类植物一致;VPE2和VPE3含有多个成员,表明其发生了基因复制。CMPG1-V是本实验室前期在簇毛麦中克隆的抗白粉病相关基因（Zhu et al.,2015）,为解析其抗性机制,利用CMPG1-V作为诱饵,筛选簇毛麦酵母双杂交cDNA文库,发现在互作蛋白基因中包括一个VPE3同源序列。进一步在簇毛麦中克隆其全长,并命名为VPE3-V。该基因具有VPE保守的结构域Peptidase C13和N端信号肽;双分子荧光互补实验（BiFC）发现,VPE3-V和CMPG1-V可以直接互作;簇毛麦受白粉菌诱导VPE3-V表达下调,推测其负向调控白粉病抗性。在感病品种扬麦158叶片表皮细胞中瞬间沉默VPE3可以降低其吸器指数（74.44%,低于单独转化GUS对照的吸器指数78.82%）,进一步证明VPE3-V可能负向调控小麦对白粉菌的吸器形成前的抗性。利用转基因RNAi技术在扬麦158中沉默VPE3,获得VPE3基因表达量降低的转基因植株,并对其进行抗性鉴定发现,沉默该基因可以提高成株期的白粉病抗性（转基因沉默植株平均病级为5～6级,受体扬麦158为8～9级）。4、节节麦品系2002I-02白粉病抗性基因的分子定位本实验室前期研究发现,节节麦品系2002I-02高抗小麦白粉病（彭效瑾,2017）。本研究利用构建的（2002I-02×2002I-11）F2分离群体,进一步进行抗性遗传分析和抗性基因定位。结果表明,F2群体抗感分离比不符合3:1,推测2002I-02的抗性不由单基因控制。对抗、感亲本和F2群体极端抗感单株构建的抗感混池（各9个单株）进行55K SNP芯片扫描,发现143个SNP与抗感池连锁,其中69个位于7D染色体上,数目最多;38个位于2D染色体上,仅次于7D。7D上39个SNP集中在4.0-15.5 Mb的物理位置,2D上13个和16个SNP分别集中在13.5-19.6Mb和62.5-82.1 Mb的物理位置,推测2002I-02的白粉病抗性基因可能位于这些基因组区域。为进一步精细定位抗性位点,根据亲本间差异SNP以及节节麦和栽培小麦位于目标区域基因的内含子差异,分别在7D和2D目标区域开发了 5个ARMS-PCR和5个Intron targeting（IT）标记,结合该区域的7个SSR标记,对F2群体进行连锁分析,构建了 7D和2D目标区域连锁图谱。整合F2群体白粉病抗性鉴定结果,通过QTL扫描,在7D和2D上分别定位了两个主效QTL,分别命名为pm-A et-7DS和pm-Aet-2DS,这与芯片分析结果一致。进一步利用7DS区域的标记对极端感病单株进行标记分析,筛选出11个重组单株,进一步将pm-Aet-7DS定位于IT-362（7.20 Mb）和IT-473（9.64 Mb）标记之间,其表型贡献率为56.5%;分析节节麦参考基因组在该区域的序列,发现此区间内包含49个编码基因,包括10个NB-ARC类型的R基因。