第一部分血清可溶性TREM2与中国汉族血管性痴呆患者认知功能的相关性研究研究目的:血管性痴呆(vascular dementia,VD)是全球第二大痴呆类型,其致死率和致残率高,严重影响患者的生活质量,给社会和家庭带来沉重的经济负担。目前VD的发病机制尚未完全阐明,针对VD也缺乏有效的干预手段。髓系细胞2中表达触发受体(triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)是一种新型的跨膜细胞免疫受体。近年来大量证据表明,TREM2与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发病机制密切相关。然而,目前尚没有TREM2参与VD发病的相关报道。本研究旨在探讨TREM2在VD中的作用及机制。研究方法:该研究共纳入120例VD患者和120例健康志愿者,分为血管性痴呆(VD)组和健康对照(Normal control,NC)组。临床医师采集所有研究对照的人口统计学指标包括年龄、性别及受教育情况,同时记录临床检查结果如收缩压、舒张压、身高体重指数(Body Mass Index,BMI)、糖化血红蛋白、空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白等临床统计学指标。由经过培训的医师对认知功能进行评测,采用简易精神状态检查(mini-mental state examination,MMSE)法,评测医师不清楚受试者的分组情况。所有研究对象于入组次日早晨采集外周血,采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清可溶性TREM2(solution TREM2,sTREM2)的水平。结果:(1)人口统计学指标:VD组与NC组的年龄(70.4±6.0岁VS 70.9±6.7岁)、性别(男/女:74/46 VS 67/53)及受教育年限(7.4±2.1年VS 7.9±1.9年)相比较,均无统计学差异(p>0.05);(2)临床统计学指标:VD组与NC组的收缩压(149.7±12.1mmHg VS 147.2±10.3 mmHg)、舒张压(95.1±8.5 mmHg VS 93.6±9.7 mmHg)、身高体重指数(24.7±1.4 VS 24.4±1.2)、糖化血红蛋白(6.51±0.74mm/L VS 6.39±0.82 mm/L)、空腹血糖(6.65±0.80 mm/L VS 6.53±0.91 mm/L)、总胆固醇(4.56±0.73 mm/L VS 4.70±0.88 mm/L)、甘油三酯(1.63±0.22 mm/L VS 1.60±0.19 mm/L)、高密度脂蛋白(1.25±0.1 8 mm/L VS 1.28±0.14 mm/L)及低密度脂蛋白(2.62±0.18 mm/L VS 2.58±0.23 mm/L)相比较,差异均无统计学差异(p>0.05);(3)MMSE评分:VD组与NC组的MMSE评分分别为(22.8±1.7)分和(27.8±1.0)分,差异有统计学意义(p<0.001);(4)血清sTREM2水平:VD组与NC组的血清sTREM2水平分别为(214.2±16.9)pg/ml 和(220.5±14.7)pg/ml。与 NC 组相比,VD组患者血清sTREM2水平明显降低,差异有统计学意义(p=0.002);(5)相关分析:在VD组患者中,MMSE评分分别与人口统计学、临床统计学指标及血清sTREM2水平行皮尔森相关分析。结果表明,VD组患者的MMSE评分与血清 sTREM2水平呈正相关(r=0.387,P=0.008),而与年龄(r=-0.271,p=0.081)、性别(r=0.293,p=0.167)、受教育年限(r=0.245,p=0.193)、收缩压(r=0.306,p=0.528)、舒张压(r=0.264,p=0.456)、身高体重指数(r=-0.312,p=0.304)、糖化血红蛋白(r=0.229,p=0.240)、空腹血糖(r=0.275,p=0.339)、总胆固醇(r=0.428,p=0.645)、甘油三酯(r=0.333,p=0.461)、高密度脂蛋白(r=-0.251,p=0.702)及低密度脂蛋白(r=0.270,p=0.326)无明显相关(p>0.05);(6)回归分析:在VD组患者中,MMSE评分与人口统计学、临床统计学指标及血清sTREM2水平行线性回归分析。结果表明,VD组患者的MMSE评分与年龄(β=-0.228,p=0.071)、性别(β=0.309,p=0.113)、受教育年限(β=0.270,p=0.196)、收缩压(β=0.261,p=0.414)、舒张压(β=0.237,p=0.372)、身高体重指数(β=-0.385,p=0.229)、糖化血红蛋白(β=0.409,p=0.318)、空腹血糖(β=0.325,p=0.421)、总胆固醇(β=0.283,p=0.679)、甘油三酯(β=0.362,p=0.506)、高密度脂蛋白(β=-0.413,p=0.437)及低密度脂蛋白(β=0.334,p=0.658)无明显因果关系,而与血清sTREM2水平存在明显的因果关系(β=0.396,p<0.001),这种相关性独立于人口统计学指标和临床统计学指标。结论:(1)VD患者血清sTREM2水平明显降低;(2)血清sTREM2水平是VD患者认知功能损伤的独立危险因素,可作为预测VD患者认知功能一种潜在的生物学标志物。第二部分过表达TREM2改善血管性痴呆小鼠认知功能的机制研究研究目的:血管性痴呆(vascular dementia,VD)是仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的第二大痴呆类型。随着人口老龄化社会的到来,其发病率逐年升高,已成为重要的社会公共卫生问题。尽管过去几十年针对血管性痴呆的研究取得一定进展,但其发病机制仍未完全明确,而神经炎症被认为在血管性痴呆的发病中起着重要作用。髓系细胞2中表达触发受体(triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)是一种主要表达在小胶质细胞上的跨膜受体,近来的研究表明TREM2在免疫应答过程中具有抗炎作用。然而,TREM2在血管性痴呆中的抗炎作用迄今尚未见报道。因此,本研究旨在探讨TREM2在血管性痴呆中的作用及潜在机制。研究方法:30只8周龄的C57BL/6J小鼠,采用短暂性双侧颈总动脉结扎(Bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)法制作血管性痴呆模型,分为假手术对照(Sham)组和血管性痴呆(VD)组,其中,Sham组小鼠只分离双侧颈总动脉而不结扎。反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Western Blots)法分别检测Sham组和造模后第1天、第3天、第5天、第7天、第14天及第28天VD组TREM2的基因和蛋白表达量,明确TREM2在VD中的表达变化。VD组小鼠根据是否给予侧脑室注射TREM2过表达慢病毒(a lentiviral vector that encoded TREM2,LV-TREM2)分为 TREM2 过表达慢病毒对照VD 组(LV-control)组和 TREM2 过表达慢病毒 VD(LV-TREM2)组,Sham组和LV-control组小鼠均给予侧脑室空白对照载体注射。各组小鼠侧脑室注射慢病毒载体4周后,行Morris水迷宫检测,以检测其空间学习记忆能力。Morris水迷宫检测后,麻醉并处死小鼠,制作小鼠海马CA1区层面的石蜡切片,免疫组化法检测各组小鼠海马组织中M1型小胶质细胞标志物iNOS及M2型小胶质细胞标志物Arg-1的表达量,同时提取海马总蛋白,并BCA(Bicinchonininc acid,BCA)法测蛋白浓度后,应用Western blots法进一步证实iNOS及Arg-1的表达变化;同时应用RT-PCR法检测各组小鼠海马中促炎因子(IL-1β、IL-6 及 TNF-α)、抗炎因子(IL-4、IL-10 及 TGFβ)及炎症趋化因子(MIP-lα及MCP-1)的基因水平;最后,在各组小鼠海马CA1区石蜡切片中行尼氏染色,以检测各组小鼠海马神经元的凋亡水平。结果:(1)TREM2的基因和蛋白水平:VD组小鼠造模后第1天、第3天、第5天、第7天、第14天及第28天的TREM2基因及蛋白水平均明显高于Sham组(p<0.05),其中TREM2的高峰值出现在造模后的第3天;(2)Morris水迷宫的结果显示:Sham组、LV-control组及LV-TREM2组小鼠的游泳速度分别为(12.34±0.96)cm/s、(12.23±1.01)cm/s及(12.29±1.05)cm/s,三组小鼠游泳速度的组间比较均无明显差异(p>0.05);Sham 组、LV-control 组及 LV-TREM2 组小鼠的第 1-4天的逃避潜伏期分别为[(62.30±3.12)cm/s、(41.50±2.34)s、(23.40±2.10)s 及(16.23± 1.28)s]、[(62.42±3.18)cm/s、(56.89±2.97)s、(46.79±2.54)s及(35.17±1.95)s]及[(62.51±3.16)cm/s、(50.90±2.61)s、(38.05±2.03)s及(26.72±1.52)s],结果表明训练第1天,三组小鼠逃避潜伏期的组间比较均无明显差异(p>0.05),而训练第2-4天LV-TREM2组小鼠的逃避潜伏期较LV-control组小鼠明显缩短,差异有统计学意义(p<0.05);Sham组、LV-control组及LV-TREM2组小鼠的原平台象限时间分别为(65.33±3.25)cm/s、(42.16±2.31)cm/s及(54.67±2.78)s,LV-control组小鼠的原平台象限时间较LV-TREM2组小鼠明显缩短,三组小鼠原平台象限时间的组间比较均有明显差异(p<0.05);Sham 组、LV-control 组及 LV-TREM2 组小鼠的穿越原平台象限的次数分别为(6.23±0.45)cm/s、(2.36±0.39)cm/s及(4.28±0.41)s,LV-control组小鼠的穿越原平台象限的次数较LV-TREM2组小鼠明显减少,三组小鼠穿越原平台象限的次数时间的组间比较均有明显差异(p<0.05);(3)小胶质细胞表型检测:免疫组化和Western blots的结果显示,与LV-control组小鼠相比,LV-TREM2组小鼠M1型小胶质细胞标志物iNOS的表达量明显减少,而M2型小胶质细胞标志物Arg-1的表达量明显增多,表明TREM2可促进小胶质细胞向M2型极化。三组小鼠间iNOS及Arg-1表达量的比较均有统计学意义(p<0.05);(4)炎症因子:RT-PCR的结果表明,与LV-control组小鼠相比,LV-TREM2组小鼠海马脑组织中促炎因子(IL-lβ、IL-6及TNF-α)的基因水平明显下降、抗炎因子(IL-4、IL-10及TGF(β)及炎症趋化因子(MIP-1α MCP-1)的基因水平明显增加,表明TREM2可抑制M1型小胶质细胞介导的促炎因子表达,并促进M2型小胶质细胞介导的抗炎因子的表达。三组小鼠间促炎因子、抗炎因子及炎性趋化因子间基因水平的比较均有统计学意义(p<0.05);(5)海马神经元凋亡:尼氏染色结果显示,Sham组、LV-control组及LV-TREM2组小鼠的海马尼氏染色阳性神经元的比例分别为(0.84±0.06)、(0.37±0.03)及(0.72±0.05)。与 LV-control 组相比,LV-TREM2组小鼠海马神经元的凋亡明显减少。三组小鼠海马尼氏染色阳性神经元比例的组间比较均有统计学差异(p<0.05)。结论:(1)VD小鼠造模后TREM2的表达量明显升高;(2)过表达TREM2可明显改善VD小鼠的空间学习记忆功能;(3)在VD中,TREM2可能通过促进小胶质细胞向M2型极化、减少炎症损伤及神经元凋亡,从而发挥神经保护作用。