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一背景与目的:使用BCG作为初免疫苗的异源性初免增强方案,可能将成为最有希望的新型TB免疫措施。ESAT-6和Ag85A是机体抗TB感染的两个主要的保护性抗原。本研究中,我们克隆了ESAT-6和Ag85A的融合基因,分别构建了表达ESAT-6和Ag85A融合蛋白的原核表达质粒pPro685A和真核表达质粒pcD685A,研究了pcD685A增强BCG初免诱导的免疫反应,同时探讨pcD685A增强BCG初免对小鼠抗TB感染的保护性。二方法:1.利用PCR技术从M.tb H37Rv株中扩增Ag85A编码基因fbpA和ESAT-6编码基因esxA,利用基因拼接(GeneSOEing)方法,合成esxA-fbpA融合基因,并分别克隆入原核表达载体pProEXHTb和真核表达载体PcDNA3.1(+)中,重组质粒命名为pPro685A和pcD685A。2.将pPro685A重组原核表达质粒转化入感受态大肠杆菌BL21,诱导并纯化出r685A蛋白。蛋白的表达和纯化的过程,分别用SDS-PAGE验证,并用anti-ESAT-6和anti-Ag85A Ab经Western blotting验证。纯化r685A蛋白的纯度进一步用SDS-PAGE证实,并经BCA法定量。3.将pcD685A重组质粒转化入感受态E.coli DH5α,规模化提取、纯化pcD685A重组质粒,并经分光光度法测定质粒浓度。4.利用BCG(中国株)初免pcD685A增强的方式免疫C57BL/6小鼠。通过ELISA法检测外周血抗r685A蛋白IgG抗体,qRT-PCR检测肺脏表达的IFN-γ和IL-10的手段,来评价在小鼠模型中的免疫原性。5.对免疫后小鼠用M.tb H37Rv毒株攻击实验进行攻击,测定组织荷菌量、组织病理学改变等指标评价疫苗的保护性。三结果:1.成功的构建了esxA-fbpA融合基因的真核表达载体和原核表达载体。2. SDS-PAGE和Western blotting证实r685A原核表达和纯化成功。纯化的r685A经SDS-PAGE证实。3. pcD685A诱导表达了特异性IgG的抗体反应,BCG初免pcD685A增强免疫组明显高于其它组。qRT-PCR检测肺脏细胞因子,除了空载体组,其他各组的IFN-γ反应水平均增加。pcD685A增强BCG初免组诱导小鼠肺脏产生了最高剂量的IFN-γ,并比单独BCG组或者pcD685A组IFN-γ有显著提高。4.更重要的是pcD685A增强免疫BCG初免与单独BCG或pcD685A组相比,能明显的减少肺脏和脾脏的荷菌量。5.小鼠用M.tb H37Rv毒株攻击后,肺脏组织病理学检查结果显示BCG初免pcD685A增强组的肺脏病理变化最轻微。四结论:因此,我们的研究显示pcD685A可能将是一种有效地增强BCG免疫的抗TB疫苗。