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纳米抗体是酶联免疫分析（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）的研究热点和发展趋势。由于获得农药小分子纳米抗体所需的时间较长,费用较高,且成功率较低,因此靶向改造现有纳米抗体从而进一步提高其灵敏性和特异性成为农药学研究的热点领域。2,4-D是一种传统且广泛应用的高效除草剂,近几年在我国抗性杂草治理中又发挥出重要作用。但由于其飘移药害及对非靶标生物构成的危害愈加突出,因此构建其高效检测分析方法具有重要意义。本实验室前期已获得能够特异性识别2,4-D的纳米抗体,但环境中复杂的基质效应是影响纳米抗体灵敏性的重要限制因素。因此,为进一步提高纳米抗体的灵敏性,扩大其应用范围,本研究通过计算机同源模建及分子对接技术,基因定点突变技术及构建随机突变库的方法,结合ELISA技术获得并鉴定纳米抗体特异性动态识别与结合2,4-D的关键氨基酸位点,在此基础上对明确的关键氨基酸位点进行饱和突变,筛选并以期获得灵敏性和特异性更高的纳米抗体。此外,为实现2,4-D的现场快速检测,本研究在获得高灵敏性纳米抗体的基础上开发了一种胶体金免疫分析方法,从而为扩大2,4-D纳米抗体的应用范围奠定了基础,也为其他农药纳米抗体的靶向结构改造提供一定参考。具体研究结果如下:1.2,4-D纳米抗体同源模建及分子对接。利用YASARA软件进行2,4-D纳米抗体的同源性建模,将总体打分最高的6个晶体作为模板生成最优模型并用SAVES网站评估确定为合格模型。在此基础上,利用计算机分子对接技术分析纳米抗体和2,4-D的特异性识别与结合过程。根据分子对接结果,初步明确了纳米抗体识别与结合2,4-D过程中起关键作用的5个氨基酸位点,分别是:Phe 37、Cys 50、Tyr 59、Ser 102和Gln 105。经分析得到,Ser 102和Gln 105与2,4-D之间相互作用力为氢键,Tyr 59、Phe 37和Cys 50与2,4-D之间相互作用力为疏水作用。通过对比氨基酸在序列中的位置发现2,4-D与纳米抗体的结合主要发生在CDR2和CDR3区所形成的口袋中。2.丙氨酸扫描突变。通过分子生物学技术对5个关键氨基酸位点进行验证。首先将5个关键氨基酸位点分别突变为丙氨酸并进行纳米抗体的灵敏性测定。结果显示,Phe 37突变为丙氨酸后,所得突变型纳米抗体失去对2,4-D的亲和活性;Cys 50和Tyr 59突变为丙氨酸后,两位点所得突变型纳米抗体均对2,4-D的亲和性能降低。而Ser 102和Gln 105位点在定点突变为丙氨酸后,所获得的两种突变型纳米抗体与野生型纳米抗体在灵敏性方面没有显著变化。此外,利用计算机辅助技术分析5种突变型纳米抗体与2,4-D结合模式,发现Phe 37、Tyr 59和Cys 50三个位点的丙氨酸突变体与2,4-D的结合能均有不同幅度的下降;Ser 102和Gln 105两个位点的丙氨酸突变体结合能变化较小,推测这两个位点与2,4-D之间的结合力较弱。结果表明,Ser 102和Gln 105位点尚有改造空间,因此进一步以这两个氨基酸位点为定点饱和突变对象对纳米抗体进行突变并测定突变型纳米抗体与2,4-D的亲和力变化。3.2,4-D纳米抗体突变文库的构建。将Ser 102和Gln 105位点分别进行定点饱和突变,结果筛选得到一株纳米抗体突变株105-Cys。间接竞争ELISA试验结果表明,该突变株的IC50为23.98 ng/mL,线性范围为2.71～212.5 ng/mL,相比于野生型纳米抗体（IC50=29.2ng/mL）,其亲和力有所提高。通过利用YASARA软件对野生型和突变型两种纳米抗体的分子结构进行重叠、优化及对比发现它们与2,4-D的结合能产生变化。结果显示,当105位点由谷氨酸（Gln）突变为半胱氨酸（Cys）后,虽然二者结合能有轻微下降,但该位点与2,4-D的结合力却有所提高。采用随机突变试剂盒对纳米抗体原始序列进行随机突变。Mut Enhancer添加量分别设置为3.0,3.2,3.5,3.8 μL。结果显示:Mut Enhancer添加量为3.8μL时,蛋白质序列发生发生较大范围突变,当Mut Enhancer添加量为其他三个浓度时,可以发现,天冬氨酸（D）偏向于突变为天冬酰胺（N）,精氨酸（R）偏向于突变为赖氨酸（K）。将不同Mut Enhancer添加量的突变体表达并纯化,发现其对2,4-D亲和性能没有提高。4.基于突变型2,4-D纳米抗体的胶体金免疫分析方法的建立。基于上述得到的纳米抗体突变株与胶体金纳米颗粒结合,构建了一种现场快速检测2,4-D残留的免疫分析方法。结果表明,纳米抗体与胶体金标记条件最适pH为8.5～9.0,抗体最适添加量为23.1 μL/100 μL,试纸条最适包被抗原稀释浓度为1:10。在此条件下,所制备的胶体金免疫层析试纸条最低检测限（Limit of Detection,LOD）为70 ng/mL。利用2,4-二氯苯甲酸,2,4-二氯苯氧乙酸甲酯,2,4-二氯苯氧丁酸,2-（4-氯-2-甲基苯氧基）丙酸,2-甲基-4-氯苯氧乙酸等5种结构类似物对所构建方法的特异性进行评估,其中2-甲基-4-氯苯氧乙酸对2,4-D有一定交叉反应,其他结构类似物都表现出较低交叉反应,表明特异性良好。