论文部分内容阅读
研究目的:基于目标捕获高通量测序的研究结果从分子遗传学角度验证及探讨东北地区汉族人群ACE基因多态性与非梗阻性无精子症发生之间的联系,为非梗阻性无精子症的遗传学诊断与治疗提供理论及实验依据。研究方法:选取自2013年2月至2016年2月因“不育”到吉林大学第一医院生殖·产前诊断中心就诊的东北地区汉族男性,经检查确诊为“非梗阻性无精子症”患者,作为NOA实验组。共收录患者121例。选取自2013年9月至2015年11月到吉林省人类精子库捐精,经精液常规分析精子密度和精子活力等指标均未见异常的志愿者,作为对照组,共计纳入符合筛选条件志愿者256例。两组受试者填写相关调查问卷,选择符合标准人群:汉族人群、睾丸查体正常、外周血G-显带染色体核型和外周血Y染色体无精子因子(Azoospermia factor,AZF)报道正常,排除有高热病史、长期辐射接触史、腮腺炎病史、身体重大疾患史、生殖器外伤史、放化疗治疗史、重度(III度)精索静脉曲张等病史。对NOA实验组与对照组人群的精液进行处理分析,记录结果;应用商品化检测试剂盒检测生殖激素的水平并进行分析;对所有受试者进行常规染色体核型分析并记录;聚合酶链式反应检测受试者Y染色体AZF是否缺失;应用外周血基因组DNA提取试剂盒依照标准流程提取受试者外周血DNA,PCR测序分型技术对基因多态性位点进行识别、检测及基因分型,琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,3730测序仪电泳检测基因分型结果,采用单体型分析软件分析同一条染色体上的单核苷酸多态性位点(Single nucleotide polymorphism,SNP);应用统计学分析软件SPSS19.0进行数据的统计学分析。研究结果:1.本次研究共得到NOA实验组患者121例,正常对照组256例。对受试者基本信息的收集和临床指标检测结果如下:NOA组平均年龄、BMI指数显著高于对照组(30.00±5.69 vs 25.35±5.51、25.31±5.13 vs 22.89±3.83);血清FSH、LH、PRL水平显著高于对照组(19.42±11.62 vs3.35±1.58、9.17±5.20 vs 4.96±2.05、409.28±215.19 vs 305.11±168.37);精浆中果糖、α糖苷酶以及精浆Zn水平显著高于对照组(66.47±57.96 vs 20.40±12.88、41.25±43.95 vs30.32±18.99、7.45±5.31 vs 2.91±2.88);精子密度、精液量、睾酮、抑制素B水平显著低于对照组(0 vs 66.88±11.11、2.74±1.49 vs 3.69±1.29、12.46±6.90 vs17.72±6.43、51.90±84.52 vs 200.93±71.27);p H和血清E2水平在两组间无统计学差异不明显。2.本研究应用二元逻辑回归分析方法对两组受试者基因型频率、最小等位基因频率(Minor allele frequency,MAF)等数据进行关联分析,且基因型符合哈迪温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)并以“年龄”因素为协变量进行相关校正,结果如下:ACE基因位点rs4316、rs4331和rs4343在NOA组MAF值均为63.20%,PHWE值位0.355;对照组MAF值均为62.70%,PHWE值为0.089,组间比较p值为0.889,无统计学差异;位点rs4362在NOA组MAF值为59.10%,PHWE值为0.397,对照组MAF值为60.02%,PHWE值位0.381,组间比较p值为0.781,无统计学差异;另ACE c.81C>T(rs4316),ACE c.471A>G(rs4331),ACE c.606G>A(rs4343)和ACE c.1665T>C(rs4362)在NOA组与对照组中基因型分布也无统计学差异(p>0.05)。3.本研究应用二元逻辑回归分析方法对两组受试者的4个候选SNP位点的显隐性模型与NOA发生进行关联性分析,并以“年龄”因素为协变量进行相关校正,结果如下:显性模型中,ACE c.81C>T(rs4316),ACE c.471A>G(rs4331),ACE c.606G>A(rs4343)位点的p值均为0.070(OR=1.933,95%CI=0.948-3.941),ACE c.1665T>C(rs4362)位点的p值为0.352(OR=1.368,95%CI=0.706-2.650),组间无统计学差异,结果表明4个位点的显性模型与NOA之间无统计学相关性;隐性模型中,ACE c.81C>T(rs4316),ACE c.471A>G(rs4331),ACE c.606G>A(rs4343)位点的p值均为0.867(OR=1.045,95%CI=0.625-1.746),ACE c.1665T>C(rs4362)位点的p值为0.887(OR=0.963,95%CI=0.568-1.631),组间无统计学差异,结果表明4个位点的隐性模型与NOA之间无统计学相关性。4.ACE c.81C>T(rs4316),ACE c.471A>G(rs4331),ACE c.606G>A(rs4343),ACE c.1665T>C(rs4362)在17号染色体上,形成了覆盖一个11kb的单倍体区段,单体型分别为TGAC、CAGT、TGAT。三个单倍体之间p值均大于0.05,提示TGAC、CAGT、TGAT与NOA发生不相关。5.NOA组中生殖激素正常组与异常组SNPs基因型频率比较:ACE c.81C>T(rs4316),ACE c.471A>G(rs4331)和ACE c.606G>A(rs4343)在FSH组中p值均为0.340;LH组中p值均0.659;E2组中p值均为0.986;PRL组中p值均为0.408;抑制素B组中p值均为0.479,p>0.05,无统计学差异,提示rs4316,rs4331和rs4343位点多态性与FSH、LH、PRL、E2和抑制素B水平异常不相关。ACE c.1665T>C(rs4362)在FSH组中p=0.592;LH组中p=0.490;E2组中p=0.851;PRL组中p=0.646;抑制素B组中p=0.224;T组中p=0.129,p>0.05,无统计学差异,提示rs4362位点多态性与FSH、LH、PRL、E2、T和抑制素B水平异常不相关。ACE c.81C>T(rs4316),ACE c.471A>G(rs4331)和ACE c.606G>A(rs4343)在T组比较中异常组突变基因型频率明显低于正常组(29.2%vs 43.3%,p=0.038),有统计学差异,提示rs4316,rs4331和rs4343位点多态性与T激素水平降低呈负相关。6.NOA组中精浆生化指标正常组与异常组SNPs基因型频率比较:ACE c.81C>T(rs4316),ACE c.471A>G(rs4331)和ACE c.606G>A(rs4343)在精浆果糖组中p值均为0.954;α糖苷酶组中p值均0.778;精浆锌组中p值均为0.920;p>0.05,无统计学差异,提示NOA患者中rs4316,rs4331和rs4343位点多态性与精浆果糖、α糖苷酶和精浆锌水平异常不相关。ACE c.1665T>C(rs4362)在精浆果糖组中p值均为0.925;α糖苷酶组中p值均0.708;精浆锌组中p值均为0.881,p>0.05,无统计学差异,提示NOA患者中rs4362位点多态性与精浆果糖、α糖苷酶和精浆锌水平异常不相关。研究结论:1.东北地区汉族人群中ACE rs4316,rs4331,rs4343,rs4362位点多态性与非梗阻性无精子症发生无显著相关性。2.东北地区汉族NOA患者中ACE rs4316,rs4331,rs4343位点多态性与T降低呈负相关;与FSH、LH、PRL、E2和抑制素B及精浆生化指标异常不相关。ACE rs4362位点与生殖激素及精浆生化指标异常均不相关。