论文部分内容阅读
FNDC5(Fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5,Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5)是一种单次跨膜蛋白,其翻译后加工产物鸢尾素(irisin)是一种肌肉分泌因子。Irisin在脂肪和能量代谢中发挥重要的作用,可以促进白色脂肪细胞棕色化并增加细胞能量代谢,FNDC5还参与了神经元的发育,但对于该基因在脂肪细胞增殖和分化的影响方面缺乏了解。本研究通过构建FNDC5的过表达及干扰载体,对其在脂肪间充质干细胞增殖和成脂分化的过程进行研究,探究其对成脂作用的影响。(1)FNDC5过表达以及干扰载体的构建本实验从肌肉细胞中克隆了 FNDC5基因,将克隆得到的FNDC5片段与pIRES2-EGFP骨架载体连接,构建了 pIRES2-EGFP-FNDC5表达载体。对该载体经酶切、测序及荧光定量PCR进行验证,并将载体转入脂肪间充质干细胞检测表达效率,发现该表达载体可使FNDC5的表达提高27.5倍。同时,我们根据FNDC5及其他转录本的同源区设计2条siRNA序列,与pSIREN-RetroQ-ZsGreen骨架载体连接,得到FNDC5干扰载体。经验证正确后,转入脂肪间充质干细胞,检测后发现FNDC5的表达最多可降低34%。结果表明成功构建FNDC5基因的过表达载体pIRES2-EGFP-FNDC5和干扰载体CTC0398-1-6。(2)FNDC5对脂肪间充质干细胞增殖的影响通过脂质体转染的方法将FNDC5过表达载体转染脂肪间充质干细胞,分别于转染后24h、48h通过Western blotting检测ERK、p38和AKT蛋白及其磷酸化水平的变化。结果发现:Fndc5基因的过表达可使脂肪间充质干细胞ERK、p38的磷酸化水平升高,对AKT的磷酸化水平没有影响。结果表明FNDC5基因通过MAPK信号通路中的ERK1/2和p38蛋白的磷酸化水平影响细胞的生理活动,促进细胞增殖。(3)FNDC5对脂肪间充质干细胞成脂分化的影响通过脂质体转染的方法分别将FNDC5过表达及干扰载体转染脂肪间充质干细胞,随后诱导细胞进行成脂分化。分别于诱导后24h、48h、72h、96h、120h检测成脂分化过程中关键基因PPARy、SREBP1、ACC、FABP4的mRNA和蛋白表达水平,同时检测白色脂肪表记基因ASC1及棕色脂肪标记基因UCP1的蛋白表达水平。结果表明FNDC5基因对PPARγ、SREBP1、ACC、FABP4的mRNA表达起到促进作用,对ASC1蛋白的表达有抑制作用,但是对PPARγ、SREBP1和ACC的蛋白表达没有显著性影响。通过油红O对脂肪间充质干细胞脂滴形成的染色表明FNDC5对脂肪间充质干细胞成脂分化形成脂滴具有抑制作用。