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禽流感(Avian influenza,AI)是由A型流感病毒引起的一种人兽共患传染病,呈世界性的存在和发生。其宿主范围十分广泛,主要宿主为水生禽类,同时也可以感染哺乳动物和人类。一般情况下,禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)并不感染人类,但自1997年发生H5N1亚型禽流感病毒感染人类事件之后,相继有不同亚型禽流感病毒感染人病例出现。尤其是2013年H7N9亚型流感病毒在我国的流行,不仅给家禽养殖业带来了巨大的损失,同时造成多起人类感染该病毒死亡的事件。因此,及时开展针对流感病毒的诊断研究,对防止流感大范围流行,降低对动物及人类生命安全的危害具有重要意义。荧光定量RT﹣PCR技术(Real-time RT-PCR)是一种新型的分子核酸检测技术。本研究借助实验室已有工作平台,建立了可以检测H5和H7亚型禽流感病毒的荧光定量RT-PCR方法。根据H5N1亚型流感病毒HA和H7N9亚型流感病毒HA和NA基因序列,设计并合成相关探针和引物,建立了检测H5和A型流感病毒双重荧光定量RT-PCR和H7N9亚型及A型流感病毒三重荧光定量RT-PCR检测方法。用背景清楚的H1~H16、N1~N9亚型A型流感病毒和多种其它病原评价两种方法,均表现出了较好的特异性;在敏感性试验中,检测10倍系列稀释的H5N1和H7N9亚型病毒尿囊液的最高稀释度可以达到10-5;在重复性试验中,两种方法Cp值变异系数均<2%,重复性较好;经过分析大量临床拭子的检测结果,该检测方法与病毒分离鉴定的符合度较高。兽用生物制品标准物质可用于兽用微生物及其产物的定性鉴定或定量测定动物疫病诊断试剂及兽用生物制品生物效价等特性值或验证检验和诊断方法准确性的参考品。本研究利用H5N1和H7N9亚型灭活病毒制备了标准物质,在热稳定性试验中,分别在-20℃、4℃、37℃不同温度下保存一定时间,仍可以表现出较好的稳定性;在反复冻融试验中,经过反复16次冻融之后仍可以作为参考标准,发现标准物质较为稳定;无菌试验鉴定符合要求,同时标准物质灭活充分,可以为普通RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测方法提供参考。