在过去的数年时间中,合成生物学已在生命科学领域的各个学科中受到越来越多的关注。合成生物学是一门交叉学科,是通过将工程科学领域中的各种元件设备有效合理组合,从而实现自定义设计基因网络控制体系的目的。以人工设计的方式将天然系统中具有最佳特性的元件有效组合,可使调控体系具有可扩展性、可理解性和便于使用的特性,并有助于实现既定目标,如此基于合成生物学设计的策略是优于传统工程策略的。到目前为止,多种人工设计的合成生物学控制系统已被成功用于生物系统中,并实现了对内部化境和外部环境中刺激信号的有效鉴定。本论文中,我们描述了几种合成生物学策略用于构建模块化调控元件,该类元件可感知外界刺激信号,促使体内产生相应的应答响应,以此实现了对基因表达的特异性控制,并且实验证明某些调控元件具有高效可控的调节特性。首先,我们运用合成生物学策略构建人工设计的RNA开关使其能响应小分子化合物。在实验设计阶段,我们寻求一种行之有效的设计方法将适配体结构域和表达平台结构域在单一紧凑结构中组合起来,如此使构建的RNA开关既具有对小分子化合物的高亲和力,又具有核糖开关的特性实现对基因表达的调控。当前运用SELEX和体外筛选技术,虽获取了多种对配体具有高亲和力的DNA和RNA适配体,但这种体外定向进化筛选策略无法获取具有构象变化特性的RNA开关,这导致从头设计响应小分子化合物的核糖开关仍是一项有挑战性的工作。在本实验研究中,我们设计了一种独特的体外筛选策略可直接筛选具有构象变化特性的RNA分子开关。实验中所用的RNA筛选库是在已知的茶碱适配体基础上设计而成的,通过体外筛选可从RNA库中获取特定的RNA序列,该序列在茶碱存在的情况下具有显著的构象变化和DNA-RNA相互作用特性,并具有类似于天然核糖开关所特有的调节功能,可用于生物体内实现对目的基因的精确调控。此外本实验基于SELEX技术设计的方法学可有助于设计更加复杂的实验体系和筛选对环境因素和有毒化学物响应的RNA开关,并可根据不同配体的特异性和研究目的对RNA调控元件进行相应的改造,以此创建出受特定小分子化合物调控的RNA级联线路。同时,光遗传学作为一种高效的调控策略可实现在时间和空间维度上的精确调控,并有助于我们去认识和了解复杂的生物系统。实验研究中,我们基于噬菌体T7 RNA聚合酶构建了一系列可受光激活的基因开关。利用一种独特的设计策略,将T7RNA聚合酶在指定位置拆分,获取的拆分体系与调控结构域融合,使T7 RNA聚合酶的自组装过程受调控结构域的控制,以此实现T7 RNA聚合酶活性的可诱导调控。实验中将光照可激活的VVD结构域和其对应的突变体作为调控结构域与T7 RNA聚合酶以不同方式组合,以此构建的基因开关具有可控特性,可在避光条件下可完全失去活性,且在光照条件下聚合酶活性显著升高。此外在特定位置拆分T7 RNA聚合酶并以此构建的基因开关其具有两种调控模式,既可以通过光诱导蛋白-蛋白相互作用的方式调控转录活性,也可以通过光介导的别构效应促使T7RNA聚合酶恢复活性。除此之外,研究发现在特定位置拆分T7 RNA聚合酶所获取的拆分体系具有高度模块化的特性,可与不同类型的调控结构域如化学可诱导的结构域融合,实现基因表达的化学诱导调控。综上,基于T7RNA聚合酶构建的基因开关作为可靠便利的调控工具可在不同环境条件下光激活基因表达;甚者,对T7RNA聚合酶拆分位置和调控结构域不同调控方式的研究可有助于对T7 RNA聚合酶和其他相关蛋白进行更深层次的研究。此外,合成生物学的中心目标之一是通过可预测的方式调控基因表达以此实现对多种细胞功能的控制。在此之前,实验研究中所使用的调控元件基本上都是基于蛋白质构建的;但是随着对RNA结构特征和功能特性有了越来越全面的认识和了解后,基于RNA构建的调控元件用于基因表达调控将成为可能。相较于基于蛋白质构建的调控元件,RNA具有某些显著的优点,其便于设计,可正交调控细胞功能并有助于缓解宿主细胞自身的负担。本实验中,我们将CRISPR-dCas9系统和反义RNA(asRNA)系统组合使用,以可编辑的方式实现对E.coli细胞中特定基因的抑制或解抑制。实验证明asRNA-sgRNA之间特异性的相互作用可解除目的基因由CRISPR-dCas9系统导致的抑制状态,使目的基因表达由抑制状态变为激活状态;此外实验证明通过人工设计asRNA使其与sgRNA的不同区域相互作用,可实现对解抑制过程的精确调控。因此这种将CRISPR-dCas9系统和asRNA系统整合至同一基因线路的独特调控方式,可同时实现对多个目的基因的抑制和去抑制状态有效调节,并有助于精确调控细胞功能。