甘蓝型油菜(Brassica napus)BAN基因同源片段克隆分析及油菜花序浸泡法转基因研究

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为利用转基因技术创造甘蓝型黄籽油菜,本文克隆了与甘蓝型油菜(Brassica napus)色素生物合成有关的BAN基因同源片段,并探索了甘蓝型油菜花序浸泡法转基因新方法。参照拟南芥(Arabidopsis thaliana)BAN基因与cDNA设计引物,对甘蓝型、白菜型、芥菜型油菜,拟南芥及其它十字花科栽培品种的基因组DNA进行PCR扩增,均扩增出与拟南芥BAN基因扩增片段大小极其相似的DNA片段,提示BAN可能广泛存在于十字花科植物中。PCR产物经克隆测序和比较分析显示,拟南芥BAN片段(779bp)与已报道的完全相同,甘蓝型油菜BAN片段(780bp)与拟南芥BAN外显子的同源性为90%,但内含子的同源性仅为74%。将甘蓝型油菜BAN氨基酸序列进行同源比较,发现甘蓝型油菜BAN片段的181个氨基酸与拟南芥有78%的氨基酸序列相同,相似性达87%;与80多种植物的NADPH还原酶类也有不同程度的同源性(55%-64%)。 在油菜花序浸泡法(noral dip)转基因的研究中,用含双元载体及报告基因的农杆菌在生产大田直接浸染正在开放的油菜花朵。分别处理开花授粉前、开花授粉时、开花授粉后的花序3,600、12,200、800个,期望发现油菜大田转基因的最佳时期。为探索农杆菌从受伤部位入侵并转化植物的可能性,另设农杆菌直接侵染受伤子房(去掉花柱)的处理。从总共16,660个进行了转基因操作的花序上共收获1,268克成熟种子。为筛选卡那霉素抗性的转基因植株,还进行了甘蓝型油菜卡那霉素敏感性实验。将正常甘蓝型油菜种子表面消毒后,接种于不同浓度卡那霉素MS琼脂培养基上,光照培养、筛选。两次实验的结果初步确定甘蓝型油菜“蜀杂9号”的卡那霉素敏感浓度为15-20U咖I。以上研究工作,为最终筛选到转基因植株,建立花序浸泡转基因方法奠定了基础。
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