猪发酵床养殖中芽孢杆菌菌株的筛选、鉴定及产蛋白酶条件的优化

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优良高活性芽孢杆菌菌株的筛选是发酵床养猪的技术关键,而优良高活性芽孢杆菌菌株只有具有生长繁殖速度快,含分解粪污有害物质的酶量多且对大肠杆菌、沙门氏菌等有害细菌具有显著的抑制作用、能够使猪粪尿中的有机物质得到充分的分解和转化等特性,才能达到发酵床养猪的目的。从本地猪场采集样品分离得到20株芽孢杆菌菌株,对20株芽孢杆菌菌株分泌蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶的活力进行了初筛和复筛,初筛采用平板培养、染色法,复筛采用分光光度计比色法来测定芽孢杆菌培养液酶活力。筛选出了胞外酶活力高的2株芽孢杆菌,其编号分别为Yb16、Yb17,其分泌胞外酶活分别达到:蛋白酶2.509 u/ml(Yb16)、2.576 u/ml(Yb17);淀粉酶2.000u/ml(Yb16)、3.2500u/ml(Yb17);纤维素酶6.0643u/ml(Yb16)、4.6126u/ml(Yb17)。以3株常见的条件性病原微生物为指示菌,采用双层琼脂平板法对2株芽孢杆菌进行抑菌试验,筛选到芽孢杆菌Yb17具有较好的抑菌效果,可作为备用菌株。利用形态学观察,生理生化试验,及16S rRNA序列测定,与GenBank序列比对,菌株Yb17鉴定为巨大芽孢杆菌。芽孢杆菌Yb17对酸和胆盐的耐受能力较强,小鼠安全性试验结果表明,芽孢杆菌Yb17安全无毒副作用。采用单因素设计,分别研究温度、起始pH、培养时间和接种量等因素对芽孢杆菌Yb17产蛋白酶的影响;根据单因素测定结果,设计四因素三水平正交实验(L9(34))优化芽孢杆菌Yb17产蛋白酶条件,确定最佳产酶条件为:温度30℃,起始pH7.5,发酵时间18h,接种量1%。
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