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目的:探讨何首乌提取物抑制大肠癌LoVo细胞生长的机制,为其预防及治疗大肠癌提供理论基础。 方法:本实验应用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测不同浓度的何首乌提取物对人类大肠癌LoVo细胞的增殖抑制作用。收集指数期生长期的大肠癌LoVo细胞,铺96孔板,各孔加LoVo细胞悬液200μl。在5%CO2,95%O2,37℃培养箱6h,待细胞完全贴壁后,更换无血清培养液后继续培养12 h。观察各孔细胞状态,各孔更换新的无血清细胞培养液,依次加入不同浓度(终浓度为0、50、100、150、200μg/ml)的何首乌提取物200μl,每个加药浓度设6个复孔,分别继续培养24h、48h。至药物作用时间,弃培养液,每孔加新无血清培养液180μl/孔。每孔加入20μl CCK-8溶液。同时设置调零孔。避光,在细胞培养箱孵育1h。取450nm测定各孔的吸光度。结果用3组独立实验数据均数±标准差表示,计算细胞的半数抑制率(IC50值),并绘制细胞的生存曲线。Western blot法检测加入何首乌提取物前后大肠癌LoVo细胞中内源性脂肪酸合成酶(FAS)的表达。分别提取加入何首乌提取物后培养的LoVo细胞及未加何首乌提取物的LoVo细胞,提取细胞总蛋白。进行蛋白的浓度测定后,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,切胶,转膜,封闭,曝光,洗膜,显色,通过图像分析系统扫描分析,最后进行拍照。Reverse Transcription PCR(RT-PCR)法检测加入何首乌提取物前后大肠癌LoVo细胞中p21Cip1,p57Kip2基因的变化。提取加药前后的LoVo细胞的总RNA,将其逆转录为cDNA,进行PCR检测。扩增的产物进行电泳,使用凝胶图像分析系统采集图像并拍照记录。 结果:CCK-8结果显示何首乌提取物对人大肠癌LoVo细胞有明显的增殖抑制作用。何首乌提取物在一定的浓度范围和一定的作用时间范围内,对大肠癌细胞抑制作用有明显的浓度依赖性及时间依赖性。FAS表达的变化应用Western blot方法检测,结果显示何首乌提取物作用后的LoVo细胞中的FAS表达明显低于未给予何首乌提取物作用的LoVo细胞,并且FAS的表达随加入何首乌提取物的浓度增加,其表达逐渐下调。RT-PCR检测LoVo细胞中的p21Cip1,p57Kip2的变化,结果显示何首乌提取物作用后的LoVo细胞中的p21Cip1,p57Kip2的表达明显高于未给予相应作用的LoVo细胞,并且p21Cip1,p57Kip2的表达随加入何首乌提取物浓度的增加,其表达逐渐上调。 结论:何首乌提取物对大肠癌LoVo细胞增殖的抑制作用,具有浓度、时间依赖性;何首乌提取物抑制大肠癌LoVo细胞的生长可能是通过增强P21、P57的作用实现的;何首乌提取物通过抑制FAS,减少内源性脂肪酸的合成,从而减少大肠癌细胞生长增殖所需的物质,抑制大肠癌LoVo细胞的增殖;P21、P57与FAS表达之间可能存在关联性,即何首乌提取物可能通过抑制FAS,促进P21、P57的表达增加,抑制大肠癌LoVo细胞增殖。