植物固定生长,持续面对多种非生物胁迫,制约着植物的生长、发育和产量。月季(Rosa chinensis)为蔷薇属植物,是世界上重要的观赏和园艺花卉。除了商业价值,还有一定的药用价值。但是,非生物胁迫例如高温、干旱等会严重影响月季的生长发育。高温下,月季进入休眠状态,不能开花,降低其观赏价值。在全球“温室效应”日益明显的今天,如何提高月季对高温等非生物胁迫的抗性的研究将具有重要意义。为了从月季中克隆高温胁迫相关的基因,本实验室将两个耐热性不同的月季品种,耐热的“曼海姆宫殿”(SM)和不耐热的“新十全”(KP),在380C处理3h。处理前后取材,进行双向电泳。挑选了3个在热激后的SM中高表达的蛋白,经肽质谱分析,初步推定这三个蛋白是热激蛋白、真核转录起始因子5A和胚胎发育后期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein, LEA)。本文通过同源克隆、反式PCR、3’-RACE从月季中克隆到了LEA基因的开放阅读框,序列比对发现该基因属于D95/Lea14类LEA蛋白基因,命名为RcLEA。亲水性分析显示,RcLEA蛋白不是典型的高亲水性LEA蛋白。亚细胞定位表明RcLEA蛋白定位于细胞质中。在耐热的月季SM中,38℃处理3h可诱导RcLEA的表达,但是在对热敏感的KP中,RcLEA的表达没有显著诱导。为了研究RcLEA的功能将其转入大肠杆菌和拟南芥。转入RcLEA的大肠杆菌在高低温胁迫下的存活率显著高于转入空载体的大肠杆菌,在含NaCl或H2O2的胁迫培养基上生长状况也要好于野生型和转入空载的大肠杆菌,说明RcLEA的表达增强了大肠杆菌对高低温、高盐、氧化胁迫的抗性。对于野生型和转基因拟南芥也进行了高低温胁迫处理。转基因拟南芥处理后的电导率低于野生型,并且具有较高的过氧化氢酶活性,3,3’-二氨基联苯胺染色显示转基因拟南芥中过氧化物积累少于野生型。转基因拟南芥处理及恢复后的生长状况、生物重、果荚数、果荚重都显著高于野生型。但是对培养基上或土培培养的拟南芥进行NaCl或甘露醇处理,转基因与野生型植株的表型和电导率都没有明显的差异。以上结果说明在拟南芥中表达RcLEA提高了拟南芥的高低温胁迫耐受性,而没有影响其对NaCl和渗透胁迫的抗性。另外,还通过体外实验证明了RcLEA蛋白能够在反复冻融情况下保护LDH (lactate dehydrogenase)的活性,还能防止高温下CS (citrate synthase)和大肠杆菌蛋白组的聚合。RcLEA对于大肠杆菌蛋白在酸性状况下的变性也有一定抑制作用,但是对于重金属毒害引起的变性则没有保护效果。双荧光互补实验表明RcLEA蛋白自身存在相互作用,其可能通过形成寡聚体而发挥其保护作用。综上所述,原核表达、转基因拟南芥的研究结果以及RcLEA的体外保护作用均证明RcLEA主要参与高低温胁迫的响应而发挥其保护作用,为接下来改善月季的高温耐受性奠定了基础。本实验室从双向电泳中得到的另一个蛋白是热激蛋白,克隆其基因全长发现是一个小分子热激蛋白,命名为RcHsp17.8。其表达受到高温和其他非生物胁迫(?)导。将其转入大肠杆菌、酵母、拟南芥发现宿主的多种非生物胁迫耐受性都提高了。为了进一步研究其表达模式和调控方式,我们克隆了RcHsp17.8翻译起(?)密码子上游1910bp的启动子序列,并将其融合β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase, GUS)转入了拟南芥。在正常培养条件下,转基因拟南芥各组织器官中都检测不到GUS表达。热激处理后,发育早期的幼苗中能观察到明显的GUS染色。花器官的柱头、花丝、心皮基部和幼嫩的果荚两端也有GUS表达,但是在成熟的果荚中,即使是热激处理后,也没有观察到GUS染色。在转基因拟南芥中,只有高温才能诱导GUS表达,其他非生物胁迫例如低温、盐、渗透等处理下的拟南芥中都没有检测到GUS。为了研究RcHspl7.8启动子上响应非生物胁迫的顺式作用元件,首先利用PlantCARE进行了预测,然后根据预测的元件的位置对启动子进行了5’端缺失,融合GUS,转入了拟南芥,对含有这些缺失片段的转基因拟南芥进行了高处理和GUS染色。结果表明,翻译起始密码子上游-178至-771之间的片段对数响应影响最大,但是这段序列却不含预测的热激元件(heat shock element,HSE),说明不仅HSE,其上下游的序列对于热激响应也很重要。重要响应热激件的确定也为该启动子的利用和开发提供了理论支持。GIGANTEA (GI)是光周期调控开花时间通路中的重要基因,而且参与生物钟的调控。其在非生物胁迫中也有一定作用,拟南芥gi突变体对于低温、氧化、(?)等胁迫的耐受性不同于野生型。因此我们对G1在胁迫中的作用进行进一步探索,以期揭示其中的机制。我们首先对长日照培养的gi-4进行了多种非生物胁迫处理,发现其对干旱、高温、盐和渗透胁迫都是敏感的。同样在短日培养条件下对gi-4进行了盐和渗透胁迫处理,gi-4同样表现出耐受性较低的表型。为了揭示GI调控非生物胁迫的机制,我们对正常培养和干旱处理下的WT和gi-4进行了数字表达谱分析。对于胁迫响应非常重要的转录因子C-REPEAT-BINDING FACTOR 3 (CBF3)的下游基因大多在gi-4中表达下调,但是定量PCR却显示CBF1、2、3的表达在gi-4中并没有下调。猜测GI对这些下游基因的调控不依赖于CBFs或通过影响CBFs蛋白水平来调控。另外,还发现AtWRKY44转录因子的表达在gi-4中显著下调。通过GI-GR(大鼠糖皮质激素受体,glucocorticoid reccptor)诱导系统和染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecitation,ChIPChIP)实验证明了WRKY44是GI的直接下游基因,并且wrky44对盐胁迫耐受性低于WT,说明GI可能通过WRKY44参与盐胁迫。