两株密度感应淬灭新菌的分类鉴定及其相关特性研究

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密度感应(quorum sensing,QS)是广泛存在于细菌中的一种交流方式,通过信号分子的产生、积累与应答调控细菌的一系列生理活动。N-乙酰高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactones, AHLs)是革兰氏阴性细菌中的信号分子,与许多病原菌的致病性密切相关。密度感应淬灭(quorum quenching, QQ)指通过信号分子降解酶或小分子抑制物干扰细菌的密度感应,在不杀死细菌的情况下特异性阻断致病菌毒力基因的表达,这一方式为解决由于抗生素滥用而产生的细菌抗药性等一系列难题提供了新思路。因此,发现新的具有密度感应淬灭活性的细菌以及新的密度感应淬灭物质对于发展环境友好型病害防治手段,实现海水养殖业的可持续发展具有重要意义。本论文利用多相分类学方法对两株具有密度感应淬灭活性的新菌进行了系统的分类鉴定,对具有强密度感应淬灭活性的菌株Th78T进行了全基因组序列的测定与分析并对该菌株中的密度感应淬灭酶进行了重组表达,为这两株密度感应淬灭细菌在水产养殖业中的后续利用奠定了一定的理论基础。菌株Th78T分离自健康养殖牙鲆肠道,为革兰氏阴性、好氧、产生黄色色素的短杆状细菌,能够降解AHL信号分子。基于16S rRNA基因序列的系统进化分析结果显示菌株Th78T与拟杆菌门黄杆菌科中Flaviramulus basaltis H35T的相似性最高(96.70%)。该菌株不产生flexirubin型色素,能够进行滑行运动。其最主要的脂肪酸成分为iso-C15:03-OH、iso-C15:1G和iso-C17:03-OH;主要的极性脂为磷酯酰乙醇胺、一种未鉴定的氨基脂以及三种未鉴定的极性脂;主要的呼吸醌成分为甲基萘醌-6(MK-6)。菌株Th78T的DNA G+C含量为31.5mol%。基于以上多相分类学结果,菌株Th78T被认为是黄枝菌属的一个新种并命名为牙鲆肠黄枝菌(Flaviramulus ichthyoenteri sp. nov.)。另外一株对C6-HSL降解能力较弱的菌株T202T分离自健康养殖牙鲆的鳃,该菌株为革兰氏阴性、好氧短杆状细菌,与γ-变形菌纲科威尔氏菌科菌株Thalassomonas agariperforans M-M1T的16S rRNA基因序列相似性最高(96.58%),其最适生长条件为28oC、2~4%(w/v) NaCl以及pH7.0–8.0。主要脂肪酸为C16:0、C16:1ω7c and/or C16:1ω6c以及C16:1ω9c;主要呼吸醌为泛醌-8(Q-8);主要的极性脂为磷酯酰乙醇胺和磷脂酰甘油。菌株T202T的DNA G+C含量为37.0mol%。基于一系列遗传学特征及表型特征的鉴定结果,菌株T202T被确定为科威尔氏菌科深海短杆菌属的一个新种,并被命名为鱼深海短杆菌(Thalassotalea piscium gen. nov., sp. nov.)。利用Illumina Hiseq2000平台对菌株Th78T的全基因组序列进行了测定。菌株Th78T基因组大小为3,953,230bp,共预测得到3,451个基因、40个tRNA以及6个rRNA。选取已知典型的AHL内酯酶序列与菌株Th78T基因组进行比对发现,该基因组中的两个金属-β-内酰胺酶基因可能编码产生有活性的AHL内酯酶。除此之外,菌株Th78T基因组能够编码产生一系列消化酶,可能有利于鱼类肠道中的消化过程,同时菌株Th78T还能够利用肠道环境中的多种糖类物质如唾液酸等。与另外两株进化关系较近的黄杆菌科细菌Gaetbulibacter saemankumensis DSM17032T和Lacinutrix sp.5H-3-7-4基因组序列的比较结果显示,菌株Th78T在糖类转运与代谢方面与这两株菌存在明显的不同。对菌株Th78T中可能的AHL内酯酶基因GL001211在大肠杆菌中进行了重组表达,得到了有活性的蛋白并将其命名为FiaL。该蛋白理论分子量为32.6kDa,理论等电点为7.58,对不同链长和侧链修饰的AHL均具有降解能力,与菌株Th78T对AHL信号分子的降解特性相符合。经Blast比对发现,FiaL的同源蛋白广泛存在于黄杆菌科的海洋细菌中,说明该蛋白参与调控海洋细菌间的信息交流,在水产养殖细菌病害的控制中有潜在的应用价值。
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