背景：乳腺癌在世界范围内是女性发病率最高的恶性肿瘤，远处转移是导致患者死亡的主要原因。乳腺癌患者一旦发生远处转移，生存率将明显下降。探讨乳腺癌转移的分子机制，是目前乳腺癌研究的热点之一。上皮-间质转变（Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞形态向间充质细胞转变，通过 EMT肿瘤细胞获得迁移运动能力，业已证明 EMT与肿瘤转移密切相关。　　当前已有大量研究证实，Cullin7与肺癌、肝癌及黑色素细胞瘤等恶性肿瘤的形成密切相关，在前期研究中，我们通过外显子测序法筛选出乳腺转移候选基因Cullin7，在后续研究中利用免疫组化法在蛋白水平证实Cullin7对乳腺癌发生、进展和转移的有促进作用，但Cullin7如何引起乳腺癌发生、进展和转移，目前仍未有相关明确的报告。研究表明泛素化蛋白酶系统的紊乱与肿瘤的形成密切相关，Cullin蛋白作为泛素化蛋白酶E3 Skp-Cullin-F-box（SCF）的重要组成结构，它能特异性识别底物，介导蛋白质泛素化过程。Cullin家族成员包括 Cullin1、Cullin2、Cullin3、Cullin4A、Cullin4B、Cullin5和Cullin7，Cullin7作为 Cullin家族的一员，它与Skp1，Fbx29和Roc1构成E3复合物，参与细胞间信号传导、细胞周期进程、细胞增殖及凋亡等过程。与 Cullin7拥有相似结构和功能的Cullin4A表达上调导致乳腺癌的上皮-间质转化（EMT，Epithelial-Mesenchymal Transition），我们假设在Cullin7也存在着类似促转移的分子机制在乳腺癌转移中扮演的角色。　　本实验将利用半定量RT-PCR技术测定在乳腺癌患者的正常组织、肿瘤原发病灶和腋窝淋巴结转移病灶中Cullin7的mRNA表达量；利用瞬时转染技术、半定量RT-PCR技术和细胞划痕、迁移和侵袭实验探讨Cullin7基因与肿瘤侵袭迁移能力的关系；最后，运用半定量RT-PCR和Western Blot技术探讨Cullin7基因与转移密切相关的EMT信号通路下游靶基因的关系，在不同研究水平上探讨Cullin7通过调控EMT信号通路影响乳腺癌转移的可能。　　目的：在转录水平研究Cullin7基因与乳腺癌发生、进展和转移的关系，用乳腺癌细胞株MDA-MB-435s作用实验物探讨Cullin基因影响机制，细胞侵袭和转移行为关系，以及研究其分子生物学机制，在mRNA和蛋白质、细胞和分子水平证实Cullin7基因可能通过调控EMT通路对乳腺癌侵袭促进转移的作用以及可能机制。　　材料和方法：　　1.标本和细胞　　收集广州医科大学附属肿瘤医院乳腺肿瘤外科2011年7月~2013年7月期间经我院病理确诊并行手术治疗标本，正常乳腺组织13例，取自乳腺癌患者患侧乳房的正常乳腺组织，乳腺浸润性癌68例，包括浸润性润性导管癌57例，浸润性小叶癌4例，特殊型浸润性导管癌7例（髓样癌4例，粘液腺癌3例）。患者均为女性，年龄30-86岁之间，平均51.6岁，中位年龄50.5岁。其中乳腺癌患者，≤50岁34例，>50岁34例。Ⅰ期：19例，ⅡA期：8例，ⅡB期：13例，ⅢA期：11例，ⅢB期：3例，ⅢC期：14例。39例已发生淋巴结转移，29例无淋巴结转移。所有患者术前均未进行化疗、放疗及内分泌治疗。人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、 MDA-MB-435s、MCF-7、SK-BR-3、BT549及BT-474均购买于美国ATCC公司，复苏后培养2~3代用于本实验。　　2.方法　　2.1采用半定量 RT-PCR法检测乳腺癌患者正常组织、原发病灶以及腋窝淋巴结转移灶中Cullin7 mRNA的表达量，分析各组织中Cullin7 mRNA表达的差异，并探讨Cullin7 mRNA与乳腺癌患者临床病例特征、免疫组化以及临床因素的关系，采用两组或多组独立样本的Mann-Whitney秩和检验分析了不同乳腺组织中Cullin7 mRNA表达差异；相关性检验采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。　　2.2采用半定量RT-PCR法检测乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435s、MCF-7、SK-BR-3、BT549及BT-474中Cullin7、E-cadherin、Vimentin和GAPDH mRNA表达水平，采用瞬时转染法将Cullin7 siRNA转染至人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s，并筛选出低表达Cullin7的细胞株。利用倒置显微镜观察转染后细胞形态的改变，并使用细胞划痕实验、细胞侵袭和迁移实验明确Cullin7对人乳腺癌细胞体外迁移运动和侵袭能力的影响。　　2.3采用半定量RT-PCR和Western Blot法检测人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s在Cullin7 siRNA转染后EMT信号通路相关分子的表达情况，以探讨Cullin7对EMT信号通路的调控作用。　　结果：　　1. Cullin7 mRNA在乳腺癌患者正常组织、乳腺癌患者癌组织及和乳腺癌患者腋窝淋巴结转移灶中的表达水平分别为1.2836±0.39839、1.8430±0.86894、2.2962±0.80598，表明Cullin7在乳腺癌患者癌组织和腋窝淋巴结转移灶内的表达明显高于乳腺癌患者的正常组织，且在淋巴结转移灶内升高更明显。另外，乳腺癌患者癌组织Cullin7 mRNA的表达水平与有无家族病史呈正相关（p≤0.05）。乳腺癌患者淋巴结转移灶的 Cullin7 mRNA表达水平与淋巴结分期呈正相关（p≤0.05）。　　2.利用Cullin7 siRNA转染得到低表达Cullin7的人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s，siRNA与阴性对照组相比，MDA-MB-435s/siRNA细胞形态从间质型逆转为上皮型，体外迁移运动和侵袭能力明显降低。　　3.RT-PCR结果显示MDA-MB-435s/siRNA细胞中EMT通路转录因子Snail、Slug、Twist和Zeb-2表达明显下降(P<0.01)，间质标志物N-cadherin表达明显下调(P<0.05)；Western Blotting结果表明EMT通路转录因子Snail和Slug蛋白表达明显下降(P<0.01)，间质标志物Vimentin和N-cadherin的蛋白水平明显下调(分别为P<0.01和P<0.05)。　　结论：　　1.乳腺癌患者腋窝淋巴结转移灶中Cullin7 mRNA的表达水平显著高于乳腺癌患者癌组织和乳腺癌患者正常组织，乳腺癌患者癌组织显著高于乳腺癌患者正常组织。这提示Cullin7 mRNA高表达在乳腺癌的形成和转移中起促进作用，提示 Cullin7有可能作为乳腺癌转移的相关候选基因。另外，乳腺癌患者癌组织Cullin7 mRNA的表达水平与有家族病史呈正相关。乳腺癌患者淋巴结转移灶的Cullin7 mRNA表达水平与淋巴结分期呈正相关。实验结果表明Cullin7高表达人群患乳腺癌的风险高于普通人群，也提示了Cullin7高表达乳腺癌患者拥有较差的预后。　　2.通过RNA干扰方法使Cullin7基因表达下调，在体外实验证实转染后肿瘤细胞迁移和侵袭能力降低，反向证实Cullin7基因在乳腺癌肿瘤细胞迁移和侵袭能力的促进作用。　　3. Cullin7表达下调导致乳腺癌细胞转移能力受到抑制的机制可能为Cullin7基因表达受抑，导致EMT信号通路相关因子Snail、Slug、N-cadherin等表达下调，从而逆转EMT过程。