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金黄色葡萄球菌分选酶A(SrtA)是一种膜结合转肽酶，可将细胞质中合成的表面蛋白锚定菌体细胞壁肽聚糖上。SrtA的缺失或突变可降低病原菌的致病性，因此SrtA可作为抗感染靶酶，用于新抗菌药物的研发。此外，SrtA由于其独特的作用机制，在生物技术领域也得到了广泛的应用。本研究主要是构建GST-SrtA△N59融合蛋白表达载体pGEX-SrtA△N59，在大肠杆菌中诱导表达，采用亲和层析纯化，以获得GST-SrtA△N59融合蛋白，并对其活性进行测定。根据GenBank中SrtA基因序列(AF162687)，设计特异性引物，以重组质粒pMD20-SrtA为模板，PCR扩增除去N末端59个氨基酸残基的SrtA△N59基因，获得了约460bp的目的片段。将目的片段克隆至融合表达质粒pGEX-4T-1中，构建重组质粒pGEX-SrtA△N59，对重组质粒进行酶切及测序鉴定，结果表明成功构建了重组表达质粒pGEX-SrtA△N59。将重组质粒pGEX-SrtA△N59转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，用IPTG进行诱导表达，经SDS-PAGE检测分析，结果发现pGEX-SrtA△N59成功在大肠杆菌中表达出相对分子质量约为42KDa的GST-SrtA△N59融合蛋白，且该蛋白是可溶性表达。对诱导表达的温度和时间进行优化，优化后，目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白的40%。利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱对表达产物进行亲和层析纯化，得到纯度为98%的融合蛋白。本实验室构建的毕赤酵母GS115/pKFS-QALPETGEE-EGFP在甲醇诱导下可将分选酶的底物序列QALPETGEE及增强型绿色荧光蛋白EGFP展示在酵母表面，分选酶与该底物作用，会在苏氨酸和甘氨酸之间进行切割，使EGFP脱落，通过测定反应上清的EGFP荧光强度即可检测分选酶A的活性。将纯化得到的GST-SrtA△N59融合蛋白与展示在酵母表面的底物作用，其荧光强度值相对于阴性对照组增加了352.77，表明分离纯化后的重组分选酶A有活性。本研究对pGEX-SrtA△N59和pET32a-SrtA△N59诱导表达纯化得到的重组分选酶A的活性进行了粗略的比较，结果显示，pGEX-SrtA△N59表达纯化的重组分选酶A的活性较高。本研究实现了GST-SrtA△N59融合蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达，经亲和层析分离纯化得到纯度和活性较高的GST-SrtA△N59融合蛋白，为分选酶A的酶学性质研究及应用奠定了良好基础。