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目的探讨卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV) K15蛋白对促进内皮细胞增殖和迁移的作用以及产生这些作用与钙库操控钙内流(SOCE)之间的相互关系。同时研究K15蛋白促进细胞增殖和迁移的分子机制。方法(1)K15蛋白多克隆抗体的制备：以实验室保存的含有K15基因的重组质粒pFJ-K15P为模板,设计合成特异性引物采用普通PCR技术扩增获得含有K15基因第8个外显子(K15Pex8)的目的片段。将目的基因采用一步克隆法连接到表达载体pQE-80L上,转化感受态细胞,涂板得到单个菌落后摇菌得到重组质粒,再进行酶切测序。利用诱导剂诱导pQE-80L- K15Pex8重组蛋白的表达。10%SDS-PAGE电泳初步确定表达情况,并扩大培养重组菌,纯化K15Pex8蛋白。考马斯亮蓝法测得目的蛋白的浓度,免疫3只新西兰兔,免疫结束后采集兔心脏血,无菌分装,制备成抗K15Pex8多克隆抗体。使用间接ELISA方法测得多克隆抗体的效价。将实验室已有的两种质粒pFJ和pFJ-K15P分别转入HEK 293T细胞中,作为阴阳性对照,蛋白免疫印迹方法检测抗K15Pex8多克隆抗体对K15P-Flag蛋白的识别。(2)慢病毒颗粒的制备：以重组质粒pFJ-K15P和K15P的突变体pFJ-K15P(YF)为模板,设计特异性引物使用普通PCR方法扩增含有目的基因的片段。将目的基因采用一步克隆法连接到表达载体pCDH-CMV-GFP上,得到两种慢病毒载体。通过脂质体转染试剂将重组慢病毒载体与三种辅助质粒pMDL-PRRE, pRSV-Rev和pMD2.g共转染HEK 293T细胞包装产生慢病毒。稀释计数法测定所包装慢病毒的滴度。蛋白免疫印迹检测K15P蛋白的表达(3)K15蛋白的作用与SOCE之间的相互关系：实验室保存的质粒pFJ、pFJ-K15P和pFJ-K15P(YF)分别转染HEK 293T细胞,通过钙离子激动剂引起内钙释放,SOCE得以激活,利用莱卡TCS SP5激光共聚焦系统检测细胞内钙离子浓度的变化。用慢病毒颗粒感染人脐静脉内皮细胞(EA.hy 926),同样通过钙离子激动剂引起内钙释放,激活SOCE,利用Leica TCS SP5激光共聚焦系统分别检测慢病毒对照组、慢病毒K15P组和慢病毒K15P(YF)感染的内皮细胞内钙离子浓度的变化。Western blot检测组成SOCE最重要的两种蛋白家族STIM1和Orai11的表达。(4)K15蛋白与细胞增殖和迁移及其分子机制：利用CCK-8试剂盒检测pFJ、pFJ-K15P和pFJ-K15P(YF)分别转染HEK 293T细胞和三种慢病毒感染EA.hy 926细胞所引起的细胞增殖。划痕实验观察三种慢病毒感染EA.hy 926细胞引起的细胞迁移变化。结果 (1)经酶切和测序,成功构建含K15Pex8基因片段的重组质粒,诱导表达纯化。测得纯化的重组蛋白浓度为152.79μg/ml。免疫新西兰兔后取得心脏血80 ml,无菌分装制备成抗K15Pex8多克隆抗体。间接ELISA方法测得多克隆抗体的效价为1:6 400并且该抗体能特异性识别重组质粒pFJ-K15P转染293T细胞产生的K15P-Flag融合蛋白。(2)经酶切和测序,成功构建含K15P和K15P(YF)基因片段的重组质粒,脂质体转染试剂将重组慢病毒载体与三种辅助质粒pMDL-PRRE, pRSV-Rev和pMD2.g共转染HEK 293T细胞包装产生慢病毒颗粒,所测的病毒滴度分别为1×107TU/ml、 4×106TU/ml和2×106TU/ml。Western blot检测到感染病毒的HEK 293T细胞中K15P蛋白的表达。(3)在HEK 293T细胞中,转染pFJ-K15P细胞与转染pFJ和pFJ-K15P(YF)的细胞相比,SOCE明显增强；在EA.hy 926细胞中也得到了相似的结果。Western blot显示转染pFJ-K15P(YF)细胞STIM1蛋白表达明显下降,其他两组无明显变化；而转染pFJ-K15P的细胞与其他两组相比Orai11蛋白表达明显增强。(4)在HEK 293T和EA.hy 926细胞中,K15P组与对照组和K15P突变体组相比,细胞增殖和迁移明显增强。结论初步鉴定得出所制备的多克隆抗体能特异性识别K15P-Flag融合蛋白。成功构建了慢病毒表达载体,并建立了高效表达K15P及其突变体的慢病毒系统。在HEK 293T和EA.hy 926细胞中,K15P蛋白能明显增强SOCE,同时STMl的表达虽没有显著变化但Oraill的表达明显增加,而K15P(YF)蛋白显著减弱SOCE, STM1,Oraill表达明显下降,细胞增殖实验和细胞迁移实验更说明K15P与SOCE之间存在相互关系。