LEAFY(LFY)编码一种植物特有的转录因子,存在藻类和所有的陆生植物中。LFY同源基因具有调控细胞分裂、花分生组织和花器官形成的功能,在成花诱导调控网络中处于关键节点。相关研究表明,LFY同源基因所编码的氨基酸序列在不同种子植物中十分保守,功能也具有相似性。然而,与多数被子植物体内单拷贝的LFY同源基因明显不同的是,裸子植物中存在两类LFY同源基因(LEAFY/NEEDLY),目前,对于LFY与NLY两个高度保守的同源基因在祼子植物生殖发育中的具体功能及是否存在功能分化尚不十分清楚。本研究通过对油松LFY和NLY基因表达模式、模式植物中异源表达的功能差异油松中差异响应基因以及基因组上结合位点差异分析,阐述了Pt LFY和Pt NLY在油松中生殖发育调控中的功能特异性,为深入理解针叶树LFY同源基因在生殖发育中的具体作用及进化地位提供新的数据支撑。主要研究结果如下:(1)Pt LFY和Pt NLY基因在调控油松生殖发育具有重要作用,其中Pt NLY可能在针叶树发育过程中发挥更核心调控功能。二者在不同组织中的表达存在明显差异,主要在营养芽及花芽中表达,而在根、茎和针叶等组织几乎不表达;在雌雄球花的发育后期表达水平下降,且在雄球花中下降更为显著,花粉成熟后期Pt LFY基因不表达;尽管Pt LFY与Pt NLY具有十分相似的表达模式,但几乎在所有样本中,Pt NLY均具有更高的表达水平,可能发挥更核心的调控作用。(2)油松中LFY同源基因与拟南芥LFY基因的功能存在差异,过表达油松LFY同源基因促进下游花器官特征基因的表达,导致花器官形态变异,进一步确认Pt LFY和Pt NLY基因在调控生殖发育中发挥关键作用。构建了p35S::LFY-GFP和p35S::NLY-GFP植物表达载体,异源转化拟南芥结果表明,与野生型拟南芥相比,过表达Pt LFY和Pt NLY导致植株形态上发生了一些明显的变化,顶端花序分生组织转变成二至三朵花以及侧枝被单生花取代的表型,另外,Pt NLY转基因植株还出现莲座叶处产生单生花表型以及花变异的表型,表现为心皮数目增加;但转基因植株未观察到促进植株提前开花的表型。(3)油松Pt LFY和Pt NLY基因不能完全替代拟南芥中LFY基因发挥功能作用,且Pt NLY基因功能与拟南芥LFY基因更具有相似性。以拟南芥lfy-1突变体为背景,过表达Pt LFY和Pt NLY基因可以部分恢复lfy-1表型,其中Pt NLY在拟南芥中对花器官发育的调控功能更强;对拟南芥野生型、lfy-1突变体、Pt LFY/lfy-1及Pt NLY/lfy-1转基因植株进行RNA-seq分析发现,与Pt LFY相比,响应Pt NLY的DEGs(Differentially Expressed Genes)中有更多的基因属于At LFY靶基因,其中Pt NLY/lfy-1 DEGs中有54.8%(890/1624)的基因属于At LFY靶基因,而Pt LFY/lfy-1为39.7%(658/1658),但Pt NLY与Pt LFY仅有20-25%的调控基因存在重叠,表明两者功能并非完全冗余,Pt LFY可以独立调控一部分At LFY靶基因。(4)构建了一种农杆菌介导的高效油松愈伤组织瞬时基因表达体系。以农杆菌菌液OD600值为0.8和150μmol/L的AS侵染愈伤组织30 min,共培养3 d,具有最高的瞬时转化效率,达70.1%,且该系统在多种针叶树的组织中表现出广泛适用性;利用在油松本体组织中过表达Pt LFY和Pt NLY,筛选获得了Pt LFY和Pt NLY的下游响应基因,证实其在油松中的确存在一定的功能冗余,但同时两者也有各自独特的响应基因,为二者功能的特异性提供了直接证据。(5)初步解析了Pt LFY和Pt NLY在全基因组的结合位点及其关联基因的功能。利用DAP-Seq技术挖掘出Pt LFY和Pt NLY在全基因组范围上结合位点分别为5666个和2021个,其中,在基因启动子区Pt LFY直接结合的靶位点有765个,Pt NLY直接结合的靶位点有425个;差异结合位点GO富集分析显示,Pt LFY和Pt NLY差异结合位点主要参与维生素合成及代谢途径以及多个响应相关途径代谢途径,两者在生殖器官发育功能存在差异。