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目的:近年来,随着人口老龄化,脑缺血性疾病的发病呈上升趋势,其高发病率、高死亡率和高致残率不仅严重危害患者的健康和生活质量,同时在脑缺血性疾病中,神经元对缺血性损害极为敏感,经过一定时间的缺血后,神经元会大量死亡,此时即使恢复血液供应,神经元亦难以再生,仍然会给患者留下严重的后遗症。因此,如何提高神经元对缺血性损伤的抵抗力和耐受力,使其在蒙受较严重的缺血打击时减轻损伤、保持存活,以保证恢复血液供应后这些神经元仍能具有正常功能,对脑缺血性疾病的治疗具有很重要的现实意义。大量动物实验发现,严重脑缺血后,海马CA1区的神经元大量死亡。若预先给予实验动物轻微,不至于引起神经元损伤的脑缺血,则可以保护神经元,使其能够耐受其后的通常会引起神经元损伤的较严重的脑缺血。这一现象被称为脑缺血耐受;预先给予的轻微、短时的脑缺血称为脑缺血预处理。研究脑缺血预处理诱导脑缺血耐受的产生机制,并据此探索、开发提高神经元对缺血性损害的耐受能力的方法,可以为临床上脑缺血性疾病的治疗提供新思路。早在1984年,谷氨酸(glutamic acid,Glu)作为中枢神经系统的神经递质就已经被广泛接受。目前认为Glu是哺乳动物中枢神经系统最重要的兴奋性氨基酸类神经递质。研究证实,脑缺血时细胞外液谷氨酸等兴奋性氨基酸的浓度异常升高。这些兴奋性氨基酸与突触后膜或突触前膜的离子型或代谢型谷氨酸受体结合后,可产生神经毒效应。降低脑缺血时细胞外液中谷氨酸浓度,是防治其兴奋性毒性作用、减轻缺血性神经元损伤的重要手段。由于细胞外没有谷氨酸代谢酶,中枢神经系统细胞外的谷氨酸的代谢主要依靠兴奋性氨基酸转运体(excitatory amino acid transports,EAATs)来维持。兴奋性氨基酸转运体可以转运细胞外的谷氨酸进入细胞内,并降低谷氨酸在突触间隙的浓度。兴奋性氨基酸转运体在及时终止突触传递以及防止谷氨酸受体过度兴奋中均发挥重要作用。目前已发现5种EAATs,分别是EAAT1(GLAST)、EAAT2(GLT-1)、EAAT3(EAAC1)、EAAT4和EAAT5。一般认为,星型胶质细胞对谷氨酸的摄取能力远大于神经元,而GLAST和GLT-1为胶质细胞转运体,主要分布在星型胶质细胞。既往实验已经证明脑缺血预处理(cerebralischemic preconditioning,CIP)可使星型胶质细胞突起延长,环绕锥体神经元,同时表达大量的GLT-1,并使其对谷氨酸的摄取增强;损伤性脑缺血可致海马CA1区GLT-1表达下调,尤其死亡的锥体细胞周围下调更为明显,甚至表现为大片的GLT-1表达缺失;应用GLT-1抑制剂(dihydrokainate,DHK)、或应用GLT-1的反义寡核苷酸减少GLT-1的表达,均可抑制脑缺血预处理的脑保护作用。这些研究结果表明GLT-1确实参与脑缺血预处理所诱导的脑缺血耐受。最近有研究报道,GLT-1存在剪接变异体。根据其羧基端不同,GLT-1存在四种剪接变异体,其中3种为C末端剪接变异体,分别被命名为GLT-1a(GLT-1α)、GLT-1b(GLT-1v)以及GLT-1c(Rauen et al 2004)。1种为N末端剪接变异体(rGLT-1A)(Rozyczka and Engele 2005)。其中,GLT-1c在大鼠脑组织中表达量很低,GLT-1a和GLT-1b在大鼠的脑组织中表达丰富。GLT-1a在海马当中的表达占总GLT-1的90%左右。既往研究发现,在实验动物脑缺血缺氧的情况下GLT-1的剪接变异体的表达可发生变化,但究竟是何种类型的剪接变异体在脑缺血耐受诱导过程中发挥作用,目前尚未见到任何相关报道。鉴于GLT-1a和GLT-1b在大鼠的脑组织中表达丰富,本课题拟主要观察GLT-1a在脑缺血耐受诱导中的作用。方法:健康雄性Wistar大鼠(260~300g)96只,由河北医科大学实验动物中心提供。在实验室饲养1~2d以适应环境,然后用于实验。除了control组外,将凝闭双侧椎动脉的Wistar大鼠随机分组。具体如下:(1)Sham组(n=24):只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流;(2)脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning,CIP)组(n=24):夹闭双侧颈总动脉3min后恢复血流灌注;(3)脑缺血打击(ischemic insult,II)组(n=24):夹闭双侧颈总动脉8min后恢复血流灌注;(4)脑缺血预处理+脑缺血打击(CIP+II)组(n=24):夹闭双侧颈总动脉3min作脑缺血预处理,后恢复血流灌注。再灌注2d后,夹闭双侧颈总动脉8min作为脑缺血打击,后再恢复血流灌注;除了control组外,其他各组分别于末次手术后0min、1h、3h、6h、1d、3d、5d、7d时取海马CA1区(每个时间点n=3),后应用RT-PCR法研究GLT-1a mRNA的表达数量。结果:Control组大鼠海马GLT-1a mRNA有一定表达。0min、1h时间点比较:sham组与Control组相比明显升高(p<0.05)。CIP组与II组及sham组相比无显著差异(p>0.05)。CIP+ II组与II组相比明显升高(p<0.05)。3h、6h时间点比较:sham组与Control组相比明显升高(p<0.05)。CIP组与sham组相比明显升高(p<0.05)。II组与sham组相比稍有降低,无显著差异(p>0.05)。CIP+ II组与II组相比明显升高(p<0.05)。1d时间点:sham组与Control组相比明显升高(p<0.05)。CIP组与sham组相比明显升高(p<0.05)。II组与sham组、CIP组及CIP+ II组相比均明显降低(p<0.05)。3d时间点:sham组与Control组相比稍有升高,无显著差异(p>0.05)。CIP组与sham组相比明显升高(p<0.05)。II组与sham组、CIP组及CIP+ II组相比均明显降低(p<0.05)。5d、7d时间点比较:sham组与Control组相比无显著差异(p>0.05)。CIP组与sham组相比无显著差异(p>0.05)。II组与sham组、CIP组及CIP+II组相比均明显降低(p<0.05)。结论:8min的脑缺血打击可使实验大鼠海马CA1区锥体神经元发生明显死亡,表现为GLT-1a mRNA的表达下调;而提前做过3min脑缺血预处理后,实验大鼠则可耐受8min的脑缺血打击,表现为GLT-1a mRNA的表达上调。