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毕赤酵母表面展示系统是近年来发展较快的微生物表面展示系统之一，表面展示外源蛋白的重组毕赤酵母菌株在经过冷冻干燥或冷冻喷干后可以制备成为全细胞催化剂参与下游应用。“绿色功能表面活性剂”烷基糖苷（alkyl polyglycoside，APG）表面活性高、环境友好、对人体无毒害作用等优点。传统化学法合成烷基糖苷方法效率低，而且操作繁琐、副产物多，目前多采用糖苷转移酶和糖苷水解酶催化合成烷基糖苷。泰国红木β-葡萄糖苷酶是Jisnuson Svasti研究团队于1996年从其种子中分离得到的，同时具有β-葡萄糖苷酶和β-岩藻糖苷酶活性。它不仅能催化单糖合成同源或异源的寡糖，而且具有比苦杏仁β-葡萄糖苷酶更强的合成中长链烷基糖苷的能力。本课题通过全基因合成获得经毕赤酵母密码子优化的来源于泰国红木（Dalbergiacochinchinensis Pierre）的β-葡萄糖苷酶基因，利用实验室保存的展示型毕赤酵母表达载体pKCALB-GCWn（12,19,21,49,51,61），成功构建了19株展示型重组毕赤酵母菌株，实现了泰国红木β-葡萄糖苷酶（DCBGL）在毕赤酵母细胞上的高效表达，同时对全细胞催化剂在填充床反应器合成烷基糖苷的初步研究。本课题的研究内容和结果如下：（1）泰国红木β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母的表面展示：基于GPI型细胞壁蛋白Gcw12p、Gcw19p、Gcw21p、Gcw49p、Gcw51p、Gcw61p构建了展示型表达载体pKDCBGL-GCWn（n=12,19,21,49,51,61）和展示型重组毕赤酵母菌株GS115/pKDCBGL-GCWn（n=12,19,21,49,51,61），检测发现融合蛋白并没有对毕赤酵母菌株的生长产生明显影响。流式细胞仪、荧光显微镜、DCBGL水解酶活力的检测结果显示DCBGL在6种GPI型细胞壁蛋白的作用下均可以成功展示于毕赤酵母细胞表面，且具有生物活性。其中以Gcw61p、Gcw51p、Gcw21p作为锚定蛋白时，甲醇诱导168h，重组菌细胞表面展示DCBGL水解酶活力较高，分别为：212.67U/g、190U/g、176U/g。（2）多个锚定蛋白共表达重组毕赤酵母菌株的构建及应用：利用串联表达盒和表达载体上的筛选标记差异的方法，构建了13株2至5拷贝的多个相同或不同锚定蛋白共展示DCBGL重组毕赤酵母菌株。基于Gcw51p和Gcw61p细胞壁蛋白构建的三拷贝重组毕赤酵母菌株GS115/DCBGL-GCW(61×2+51)展示DCBGL的效果最好，水解酶活力在168h时达到747.90U/g，比一拷贝对照菌GS115/pKDCBGL-GCW61最高酶活提高了2.52倍。在本部分研究中发现，1）当重组菌的拷贝数大于4时，宿主菌的生长受到影响。2）三拷贝共展示重组菌的水解酶活力最高，这是由于提高基因拷贝数显著提高了DCBGL在毕赤酵母细胞表面上的展示酶活力，但是由于毕赤酵母细胞表面空间有限，不能保证所有展示的酶蛋白均正确折叠并表现出生物学活性，且存在外源蛋白泄露到发酵上清液中的情况。在径高比1:3的柱式填充床反应器中，反应体系包括：5.0g GS115/DCBGL-GCW(61×2+51)全细胞催化剂，8%0.2M pH3.0乙酸盐缓冲液，20g/L葡萄糖，92%正丁醇。反应温度为50℃，全细胞催化剂在柱中的填充方式分为隔层和不隔层，隔层的利用玻璃棉和泡沫进行分层。隔层柱式填充床反应器的转化率在24h就达到不隔层的最高水平（12.67%），60h的转化率达到了23.995%，隔层扩大了酶与底物的接触面积。