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毕赤酵母细胞表面展示体系是近年来发展迅速且应用广泛的一种真核表达体系，运用毕赤酵母细胞表面展示体系展示各种酶作为全细胞催化剂，不仅具有固定化酶的特性及优点，而且制备方法简单，易于回收与再生利用，因此具有广阔的应用前景。目前已有的毕赤酵母细胞表面展示体系的锚定蛋白主要是来自酿酒酵母的细胞壁蛋白，这些壁蛋白通过共价键或非共价键与细胞壁相连。共价连接的壁蛋白包括GPI型（glycosylphosphatidylinositol cell wall proteins）和PIR型（protein with internal repeats），运用最多的是GPI型的壁蛋白。毕赤酵母全基因组测序结果在2009年公布，到目前为止有很多基因还未注释，已确证的GPI型细胞壁蛋白也非常少。本研究为了拓展毕赤酵母细胞表面展示体系锚定蛋白的范围，根据GPI型壁蛋白的特点对毕赤酵母内源的可作为锚定蛋白的GPI型壁蛋白进行了筛选和确证，并在此基础上构建了多个锚定蛋白共展示体系，同时还初步探究了确证的GPI型壁蛋白Gcw14p的功能。具体研究内容及结果如下：（1）毕赤酵母GPI型细胞壁蛋白的筛选和确证根据酵母GPI型蛋白的特点，本研究首先预测到了50个毕赤酵母内源的潜在的GPI型蛋白，然后以CALB (Candida antarctic lipase B)作为外源功能蛋白，用预测到的GPI型蛋白作为锚定蛋白分别构建新的毕赤酵母表面展示体系。通过流式细胞术和WesternBlot的检测确证了13个可用作锚定蛋白的GPI型细胞壁蛋白，扩展了毕赤酵母表面展示体系锚定蛋白的范围。对各重组菌通过高密度发酵获得CALB的全细胞催化剂，流式细胞术的分析结果和CALB水解酶活的检测结果显示新的展示体系的展示量和展示酶活都有一定的增加，但不同的展示体系之间存在较大的差异。其中以Gcw12p、Gcw21p、Gcw51p和Gcw61p作为锚定蛋白时展示CALB的水解酶活在诱导表达120h较高，分别达到1538U/g、1828U/g、1889U/g和2234U/g。（2）多个锚定蛋白共表达展示体系的构建及应用选取Gcw12p、Gcw21p、Gcw51p和Gcw61p作为锚定蛋白，利用体外多拷贝构建技术和不同的筛选标记实现多个相同或不同锚定蛋白在同一宿主菌中的共展示，分别获得了基于相同或不同锚定蛋白的一至四拷贝重组菌，基于Gcw61p还获得了一株八拷贝的重组菌。对各重组菌生长情况监测的结果显示在使用毕赤酵母表面展示体系过量表达CALB时，无论使用相同还是不同的锚定蛋白，随着拷贝数的增加，重组菌在甲醇诱导下的生长都会受到一定的抑制。基因剂量是影响外源蛋白表达的重要限制因素之一，通过增加基因拷贝数可以有效提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达。在本研究的展示体系中，使用相同的锚定蛋白共展示CALB时，两拷贝重组菌的效果最好，GS115/CALB-GCW(61+61)水解酶活值在120h时达到4451U/g。使用不同的锚定蛋白共展示CALB时，三拷贝重组菌的效果最好，GS115/CALB-GCW (12+51+61)水解酶活值在120h时达到4493U/g。但共表达重组菌的酶活与所使用的锚定蛋白自身的展示效率有关，在本研究的展示体系中，目前展示效率最好的锚定蛋白是Gcw61p。重组菌细胞表面展示的蛋白量与展示酶活不是完全对应的，由于细胞表面空间位置有限，展示的酶分子可能由于空间阻碍等不能全部都表现出催化活性。冷冻电镜及细胞壁干扰剂的分析结果显示，以Gcw51p作为锚定蛋白展示CALB后，重组菌的葡聚糖层没有明显的变化，而重组菌的甘露糖蛋白层的含量和结构都发生了明显变化，由原本较为疏松伸展的状态变为紧密聚集的状态。说明融合蛋白CALB-Gcw51p确实在细胞表面成功的过量表达，且过量表达引起了细胞壁甘露糖蛋白层含量的变化及结构的重组。（3）毕赤酵母GPI型壁蛋白Gcw14p功能的初步研究在实验室之前的转录组数据中，毕赤酵母以甘油或葡萄糖为碳源生长时，GPI型壁蛋白Gcw14p对应的转录水平在整个转录组中最高，而以甲醇为碳源生长时Gcw14p对应的转录水平仅次于乙醇氧化酶aox1。因此首先选取Gcw14p使用基因敲出和过量表达等方法对其功能进行了初步探究。敲出GCW14基因后，无论是以葡萄糖还是以甘油或者甲醇为碳源，敲除菌GS115/ΔGCW14与对照菌GS115相比生长较差，说明GCW14基因虽然不是毕赤酵母生长必不可少的基因，但是敲除GCW14基因后会对毕赤酵母的生长造成一定的抑制。然后通过染色和细胞壁组分测定等方法发现敲除菌的葡聚糖和几丁质含量都有所增加，而过量分泌表达3种不同的外源蛋白（CALB、s7-XYN和EGFP）结果显示敲除菌中的表达量都比对照菌低，说明敲出GCW14基因后，敲除菌的细胞壁内层可能有一定程度的增厚，从而对外源蛋白的分泌造成了一定的阻碍作用。推测GCW14基因可能参与毕赤酵母细胞壁内层组分含量控制的过程。