端粒酶(Telomerase)由于其在肿瘤细胞中的过度表达,使其成为对癌症的早期诊断、监测及治疗有重要意义的目标检测物。从上世纪70年代起,针对端粒酶的研究就已经有了初步的进展,至今为止,在端粒酶的生物作用机制以及监测领域的科学研究依然是科学家们探究的热点。但是传统方法对于端粒酶活性的检测大多局限于对于细胞提取液中的端粒酶进行分析,原位检测端粒酶的研究方法又在某种程度上存在着缺乏信号放大方法及信号过小这样的弱点。针对当前在原位放大细胞内端粒酶信号这一科研领域的空白,核酸放大技术被引入到细胞内端粒酶的原位分析中。利用脂质体的高转染效率、低毒性等优点,将核酸放大系统引入活细胞中进行成像分析。本论文构建了基于Catalyzed Hairpin Assembly(CHA)级联放大系统对细胞内端粒酶活性进行信号放大成像。同时,由于多孔硅球的高负载能力以及其良好的生物相容性,本文同时构建了一个以多孔硅球为载体,用于检测端粒酶延长端粒长度的荧光信号标尺,可以被用于研究端粒酶的生物功能。具体工作如下所示:1、级联放大自组装方法用于细胞内端粒酶活性成像设计了一种用于细胞内端粒酶活性荧光检测的级联放大检测方法。该方法通过使用一个传递者DNA(transmitter/T),将端粒酶响应的引物延长反应与CHA信号放大系统进行串联,从而实现细胞内端粒酶活性信号的放大。相比于现有的这些1:1产生信号的端粒酶原位检测方法,本方案可以通过对传递者DNA的循环使用,获得1:n的荧光信号放大。该核酸放大系统被包裹在脂质体中,并过滤成粒径在100～200 nm的脂质体小球,充分的利用了脂质体在转染过程中良好的生物相容性,生物试剂转染的低毒性以及高渗透性。当探针进入端粒酶过表达的肿瘤细胞之后,启动子探针HPT就会在端粒酶及底物dNTPs的作用下被延长进而释放出传递者DNA(transmitter/T),传递者DNA又会成为亚稳态DNA(H1、H2)反应的催化剂,使得H1-H2复合物通过T的催化不断地形成,去打开原本荧光已经被猝灭的R-QF的荧光,并最终形成荧光“开”的信号传导系统。此时当以495nm的激光照射细胞,就能对细胞内的端粒酶活性进行特异性,灵敏的荧光信号放大成像。最终达到用催化放大的方法原位示踪端粒酶活性的目的。2、端粒酶响应的DNA纳米粒子探针用于细胞内端粒酶延长尺度的检测设计了一个基于多孔硅球为载体,检测细胞内端粒酶延长端粒长度的信号标尺(Ruler)。实验的目标是利用叠色法原理,实现端粒酶延长端粒长度的原位可视化检测。该方案通过在纳米粒子表面修饰三种不同环径的发卡DNA探针,形成对端粒酶延长端粒酶引物(TS)产物的不同尺度进行区分。由于不同环径的发卡DNA探针可以被不同延长程度的延长产物序列所打开。当端粒酶将TS引物延长1个端粒时,只有环径最小的发卡DNA能被打开;而当TS引物延长到多个端粒时,则更大的发卡荧光被打开。最后,利用叠色法,将荧光结果进行叠加,即可测得端粒酶延长TS引物的尺度,因此把这个DNA修饰的纳米探针称作是端粒酶延长程度标尺。方案在纳米粒子载体中修饰了荧光素,当修饰有发卡DNA的纳米粒子进入细胞后,即可以载体内部所产生的荧光作为内标,对发卡DNA所产生的荧光信号进行定量,并最终实现端粒酶延长尺度的微观可视化检测。通过调整反应条件,设计的基于纳米粒子作为载体的特异性测量细胞内端粒酶延长尺度的探针有望在研究端粒酶微观生物性质方面取得重要进展。