【摘 要】
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角蛋白酶广泛应用于食品、医药、美容及皮革等领域。论文从筛选高活性的角蛋白酶生产菌株出发,通过分析其基因组,从中挖掘新型的角蛋白酶基因对其进行克隆表达,并进行酶学性质及对羽毛粉降解的研究。论文的主要研究内容与结果如下:(1)经过多株芽孢杆菌酶活检测,筛选出一株较高活性角蛋白酶生产菌株,酶活达到65.90 U·m L-1,为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis SYBC H47)。(
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角蛋白酶广泛应用于食品、医药、美容及皮革等领域。论文从筛选高活性的角蛋白酶生产菌株出发,通过分析其基因组,从中挖掘新型的角蛋白酶基因对其进行克隆表达,并进行酶学性质及对羽毛粉降解的研究。论文的主要研究内容与结果如下:(1)经过多株芽孢杆菌酶活检测,筛选出一株较高活性角蛋白酶生产菌株,酶活达到65.90 U·m L-1,为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis SYBC H47)。(2)通过B.velezensis SYBC H47已知的全基因组的功能注释,筛选得到23个蛋白酶基因;对其进一步的分类后,得到4个角蛋白酶基因,分别为:baker1、baker2、baker3、baker4。对这4条角蛋白酶基因进行生物信息学分析,并且进行克隆表达验证,得到1个有活性的角蛋白酶:BaKer1;当以偶氮酪蛋白作为底物时,BaKer1的酶活最高,达到109.77 U·m L-1。测定该重组菌株的发酵生长曲线以及酶活曲线,与空载对照菌株对照,发现重组菌株的生长受到一定程度的抑制,表明角蛋白酶影响了重组菌的生长。(3)经多序列比对,显示baker1属于S8A亚家族。测得最适反应p H是9.5;最适反应温度是55℃,在中温以及碱性条件下有着较好的稳定性和耐受性。Ca2+对BaKer1有十分显著的促进作用。而Mg2+,Zn2+、Fe2+和Mn2+对酶都有一定的激活作用。浓度为5 mmol·L-1时,Ca2+对酶的促进效果减弱,Mn2+有较为明显的抑制作用,其他离子随着浓度升高促进作用更明显。EDTA会显著抑制BaKer1的酶活性,这代表酶发挥活性需要金属离子。PMSF也对BaKer1的酶活性有着显著抑制作用,表明BaKer1是典型的丝氨酸蛋白酶。DTT则对BaKer1抑制作用不强,说明BaKer1中没有二硫键的存在。有机溶剂中,异丙醇、正己烷、丙酮对BaKer1的活性几乎没有影响,但是二氯甲烷和乙醇则对其有些许抑制作用。4种表面活性剂对BaKer1的活性影响不大。分别以偶氮酪蛋白、酪蛋白为底物研究动力学参数,对BaKer1,Km值分别是1.09和1.39 mg·m L-1,kcat/Km值分别为2536.54和3733.79 s-1·(mg·m L-1)-1。(4)未经处理的羽毛粉中游离氨基酸含量很低。BaKer1处理后释放大量氨基酸,其中赖氨酸、酪氨酸释放量较高。说明BaKer1对提高羽毛粉的营养利用价值有着良好的应用前景。BaKer1降解与酸水解同样条件反应情况比较,是其效果的33.51%。虽效果BaKer1不如酸水解,但是,酶法实验条件简单,更绿色环保,成本廉价,后期产物也更加安全,有利于产物的再利用,说明酶处理法对于羽毛粉的二次绿色加工有着比较高的应用价值。
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