【目的】：　　以人3型腺病毒（Ad3）载体为基础，构建人腺病毒14型（Ad14）和55型（Ad55）表位嵌合型和六邻体置换型重组腺病毒疫苗候选株，并探讨建立人B种腺病毒感染动物模型，为人腺病毒多价疫苗研究奠定基础。　　【方法】：　　一、收集广东省部分地区120份健康体检人群的血清样品，进行细胞微量中和实验，调查血清抗人腺病毒3、4、7、14、55型中和抗体阳性比率和滴度。　　二、通过多重序列比对和同源建模，预测Ad14和Ad55六邻体蛋白的中和抗原表位，合成表位多肽，偶联KLH后免疫小鼠，通过ELISA和细胞微量中和实验鉴定中和抗原表位；进一步基因克隆获得Ad14和Ad55中和抗原表位基因嵌入Ad3六邻体的穿梭载体，细菌内同源重组获得重组质粒，转染拯救表位嵌合型重组人3型腺病毒，生长曲线测定等方法分析重组腺病毒的生长特性；纯化病毒并免疫小鼠，ELISA和细胞微量中和实验分析表位嵌合型重组腺病毒的免疫原性。　　三、PCR扩增人14型和55型腺病毒六邻体基因，克隆到穿梭载体后，与人3型腺病毒载体进行细菌内同源重组，拯救获得六邻体基因置换的衣壳嵌合型重组腺病毒rAd3H14和rAd3H55；生长曲线测定等方法分析重组腺病毒的特性；纯化重组腺病毒并免疫小鼠，ELISA和细胞微量中和实验分析其免疫原性；将rAd3H14、rAd3H55与嵌合人7型腺病毒六邻体的rAd3H7及母病毒rAd3EGFP进行混合培养，六邻体型特异Q-PCR和ELISA检测分析混合培养产物中各型腺病毒六邻体的复制和表达，纯化并免疫小鼠，或将四种重组腺病毒同比例混合后免疫小鼠，检测对人3、7、14、55型腺病毒的中和活性。　　四、用人腺病毒3、4、7、14、55型感染小鼠、犬、金仓鼠、猪、树鼩等动物的细胞系或原代细胞，通过Q-PCR和病毒感染滴度检测分析其感染能力及复制和增殖能力，WB、电镜等方法检查病毒粒子结构，为是否适合作为动物模型提供一定的细胞水平的依据；尝试滴鼻感染金仓鼠、小型猪、树鼩，采集咽拭子进行Q-PCR检测，肺组织进行Q-PCR检测、HE染色，血清进行体外中和实验等，初步筛选、建立腺病毒感染动物模型。　　【结果】：　　一、120份健康成年人血清样品中对Ad3、Ad4、Ad7、Ad14、Ad55中和抗体阳性样品的比例分别为80％、49.17%、85.83%、22.50%、20.83%，有较高滴度（>128）中和抗体的比例分别为61.67%、35.83%、59.17%、12.5%和14.16%，有高滴度（>512）中和抗体的比例分别为19.17%、5.83%、25.83%、3.33%和4.33%；人群Ad4、Ad7和Ad55血清中和抗体阳性率随着年龄增大而升高，男女人群各型别腺病毒中和抗体比例没有显著差异。　　二、预测Ad55六邻体上4个中和抗原表位分别位于HVR1、HVR2、HVR4、HVR7，合成KLH偶联肽免疫可以诱导出抗Ad55中和抗体；获得这4个表位分别嵌入人3型腺病毒六邻体相应位置的重组腺病毒质粒，但仅Ad3A55R2拯救到感染性病毒，免疫小鼠后诱导出抗Ad3和Ad55的中和抗体。　　三、预测Ad14六邻体上4个中和抗原表位分别位于HVR1、HVR2、HVR4、HVR7，合成KLH偶联肽免疫可以诱导出抗Ad14中和抗体；获得这4个表位分别嵌入人3型腺病毒六邻体相应位置的重组腺病毒质粒，但仅Ad3A14R2和Ad3A14R4拯救到感染性病毒，免疫小鼠后均诱导出抗Ad3和Ad14的中和抗体。　　四、成功制备将rAd3EGFP的六邻体分别置换为Ad14、Ad55六邻体的重组腺病毒rAd3H14和rAd3H55，其复制增殖特性与rAd3EGFP无差异，免疫小鼠后诱导出高滴度的抗Ad14和Ad55中和抗体。制备六邻体型特异表位肽抗血清和人3型和7型腺病毒型特异高中和滴度的单克隆抗体3D7等，建立了一套识别特异型别六邻体蛋白的ELISA检测体系；同时建立了一套识别特异型别六邻体基因的Q-PCR检测体系。rAd3EGFP、rAd3H7、rAd3H14、rAd3H55等四种重组腺病毒体外同比例混合后接种细胞，复制效率相近，无显著差异，ELISA检测四种型别的六邻体都可以检测到。混合培养纯化的腺病毒或各重组腺病毒同比例混合后免疫小鼠，都可以诱导出对四种型别腺病毒平衡的高滴度中和抗体应答。　　五、人3、4、14、55型腺病毒感染BALB/C小鼠原代肺、肾细胞后，观察到很少量细胞病变，rAd3EGFP感染后可以观察到少量细胞出现明显的荧光；基因组拷贝数在48hr时出现下降，而96hr时又出现了上升；产生的子代病毒滴度约10-80之间，较其在HEp2细胞中产生的病毒滴度低10-100倍。人3、4、7、14、55型腺病毒感染金仓鼠原代肺、肾细胞后，观察到不明显的少量细胞病变， rAd3EGFP感染后可以观察到极其个别的细胞出现荧光；Q-PCR没有检测到病毒基因组拷贝数的显著增长。金仓鼠用Ad55滴鼻攻毒3天后和6天后，肺部可见明显局部实变，在9天后基本上已经看不到实变。Ad4在攻毒9天后血清中和抗体滴度约64，而Ad3和Ad55在9天后诱导的血清中和抗体滴度约16-32。　　六、人腺病毒3、4、7、14和55型均可以有效感染猪肾细胞系PK15和猪原代上皮细胞，产生明显的病变效应，肾和肝原代细胞几乎100%的细胞出现病变， Q-PCR检测表明在猪上皮细胞内人腺病毒基因组拷贝数有大量增加。但人腺病毒感染猪上皮细胞后产生的子代病毒感染性较低，对PK15培养的Ad3病毒颗粒进行的电镜、电泳、WB检测表明其直径大小、病毒颗粒成份和在人细胞中培养的正常成熟病毒颗粒存在明显差异。Ad3经鼻、静脉注射感染五指山小型猪均可以引起肺组织严重炎症反应，但较快痊愈。　　七、人腺病毒3、4、7、14、55型感染树鼩肺、肾、气管原代细胞后都可以观察到典型CPE，rAd3EGFP感染树鼩原代细胞可以观察到强烈的荧光；病毒基因组拷贝数在感染后48hr即有极大增加（100-1000倍），产生的子代病毒滴度与在对照HEp2中产生的子代病毒滴度相近。Ad55对树鼩滴鼻攻毒后，部分动物咽拭子中病毒滴度在6天后仍有升高，所有动物肺组织均可见大面积或局部实变，病理切片检查发现部分动物有严重肺部炎症，个别动物9天后仍表现为严重肺炎。感染后6天血清中和抗体滴度达到256-512倍，9天达到512-1024倍。　　七、人腺病毒3、4、7、14、55型感染树鼩肺、肾、气管原代细胞后都可以观察到典型CPE，rAd3EGFP感染树鼩原代细胞可以观察到强烈的荧光；病毒基因组拷贝数在感染后48hr即有极大增加（100-1000倍），产生的子代病毒滴度与在对照HEp2中产生的子代病毒滴度相近。Ad55对树鼩滴鼻攻毒后，部分动物咽拭子中病毒滴度在6天后仍有升高，所有动物肺组织均可见大面积或局部实变，病理切片检查发现部分动物有严重肺部炎症，个别动物9天后仍表现为严重肺炎。感染后6天血清中和抗体滴度达到256-512倍，9天达到512-1024倍。　　【结论】：　　一、南方地区普通成年人群有高比例和较高滴度的Ad3和Ad7血清中和抗体，有较高比例的Ad4中和抗体，普遍缺乏对Ad14和Ad55的保护性抗体，有接种Ad14和Ad55疫苗的必要性。　　二、人55型腺病毒六邻体的氨基酸138 to152位点(A55R1)、179-187位点(A55R2)、247-259位点(A55R4)、429-443位点(A55R7)包含中和抗原表位；表位嵌合型腺病毒rAd3A55R2免疫小鼠可以诱导抗Ad3和Ad55的中和抗体应答，可以作为人3型和55型双价疫苗候选株。　　三、人14型腺病毒六邻体的氨基酸141-157位点(A14R1)、181-189位点(A14R2)、252-260位点(A14R4)和430-442位点(A14R7)包含中和抗原表位；表位嵌合型腺病毒rAd3A14R2和rAd3A14R4免疫小鼠可以诱导抗Ad3和Ad14的中和抗体应答，可以作为人3型和14型双价疫苗候选株。　　四、成功制备六邻体置换的衣壳嵌合型重组腺病毒rAd3H14和rAd3H55，可以分别作为Ad14和Ad55疫苗候选株。六邻体是人3、14、55型腺病毒在人体和小鼠体内中和抗体识别的主要抗原。rAd3E、rAd3H7、rAd3H14和rAd3H55四种重组病毒混合培养后以相近的效率复制和增殖，同比例混合免疫可以诱导平衡的抗Ad3、7、14和55型腺病毒的中和抗体应答，可以作为一种多价疫苗候选。　　五、人B种腺病毒3、7、14、55型均可以感染猪上皮细胞并高效复制，但只能产生低滴度的感染性病毒；滴鼻和静脉攻毒可以导致小型猪肺部炎症反应。　　六、人B种腺病毒3、7、14、55型对小鼠、金仓鼠上皮细胞的感染能力差，病毒基因组复制水平低，子代病毒感染力低。腺病毒滴鼻攻毒可以导致金仓鼠肺部炎症反应，但病毒很快被清除。　　七、人B种腺病毒3、7、14、55型均可以高效感染树鼩原代上皮细胞中并高效复制，产生高滴度的感染性病毒粒子。Ad55滴鼻攻毒后在树鼩体内增殖，并导致肺部严重炎症反应。树鼩有可能作为人B种腺病毒感染的动物模型。