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【研究背景和目的】特发性癫痫(idiopathic epilepsy,IE),包括特发性全面性癫痫(idiopathic generalized epilepsy,IGE)和特发性局灶性癫痫(idiopathic partial epilepsy,IPE),是指由遗传学病因所致的癫痫,占全部癫痫的40%-60%。目前大多数的IE致病基因不明。在癫痫的致病基因中,编码离子通道的基因最受重视;其中N-甲基D-天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)为配体门控型离子通道,是中枢神经系统中兴奋性突触传递、可塑性和兴奋性毒性的重要调节结构,也是多个抗癫痫药物的作用靶点。NMDAR亚基编码基因突变与多种神经精神疾病有关,包括癫痫、Alzheimer病、Huntington病、抑郁、精神分裂症、智能障碍、孤独症等,而癫痫是最重要的表型。NMDAR亚基编码基因突变形式包括错义突变、截短突变、剪切突变、插入/缺失、染色体微缺失、染色体易位和拷贝数变异等,其中错义突变占绝大多数;一般认为,错义突变的致病性体现在氨基酸置换性质改变对蛋白高级结构的影响,截短突变导致单倍体剂量不足或显性负效应影响蛋白质的功能,目前对NMDAR亚基编码基因的剪切区域突变、同义突变的致病分子机制研究较少,其致病的分子机制尚不明确,有待进一步研究。本研究通过体外剪切分析,探索NMDAR亚基编码基因突变致病的分子机制。【方法】符合入组标准的特发性癫痫患者287例,且均已通过全外显子测序,进行NMDAR亚基编码基因突变筛查,再结合分析患者的临床特征和生物信息学预测结果,入选5个突变点很可能对剪切有影响(GRIN1 c.394-1G>C;GRIN2A c.702C>T;GRIN2B c.1287C>T;GRIN2D c.690C>G和GRIN3B c.556G>A)的患者为研究对象,构建野生型minigene,pTarget-GRIN1-E2-E4、pTargetGRIN2A-E3-E5、pTarget-GRIN2B-E4-E7、pTarget-GRIN2D-E2-E4和pTargetGRIN3B-E1-E3,以野生型质粒为模板,构建相关突变质粒,运用SY5Y细胞体外表达和RT-PCR法,分析各突变体的体外剪切形式,进一步用Q-PCR分析NMDAR各亚基的编码基因突变后mRNA转录本的相对表达量。【结果】1.RT-PCR显示:GRIN1 c.394-1G>C破坏了3’端受体位点,导致3号外显子缺失2个碱基,使得翻译提前终止,形成截短NR1蛋白(p.Lys131fsX21);GRIN2A c.702C>T、GRIN2B c.1287C>T、GRIN2D c.690C>G和GRIN3B c.556G>A突变体均未见明显异常转录条带,测序结果显示对剪切无影响。2.实时荧光定量PCR显示:GRIN1 c.394-1G>C突变体的相对定量结果:c.394-1G>C异常mRNA相对量为86.45±2.7%,正常mRNA相对量为10.64±1.7%;异常与正常mRNA相对量对比,差异有统计学意义。【结论】1.GRIN1 c.394-1G>C突变很可能通过破坏原有剪切受体位点影响剪切,生成截短NR1蛋白(p.Lys131fsX21),进而导致疾病的发生。2.GRIN2A c.702C>T、GRIN2B c.1287C>T、GRIN2D c.690C>G和GRIN3B c.556G>A突变未能发现对剪切产生影响。