论文部分内容阅读
内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)是真核细胞的一种保护性应激反应,通过激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)通路来减少细胞内蛋白的异常聚集,从而起到细胞保护作用。ER应激与很多因素所致疾病的发生、发展密切相关,越来越多的证据表明,ER应激及其UPR通路可能参与机体的炎症免疫反应。ARMET(arginine-rich, mutated in early stage tumors)基因是我们从30000个基因中筛选出的对ER应激最敏感的基因,它是一种分泌性蛋白,ER应激能诱导其表达上调。故我们推测,ARMET的诱导表达可能是细胞自身的保护性调节,那么在炎症诱导的ER应激中,ARMET可能起到抑制炎症的作用。目的:在免疫性关节炎动物模型上,观察炎症诱导的ER应激及ARMET的表达情况,分析ARMET表达与炎症程度的相关性,初步探讨ER应激及ARMET表达在免疫性关节炎症中的作用。方法:用甲基化牛血清白蛋白(methylated bovine serum albumin,mBSA)诱导兔关节炎(antigen-induced arthritis,AIA)模型,核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)扫描造模前后滑膜组织增厚情况,苏木素-伊红(hematoxylin-erosin,HE)染色观察滑膜组织病理改变;注射弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant,FCA)建立大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)模型,足容积法测量继发侧足肿胀度,关节炎指数(arthritis index,AI)评分记录AA的发生及严重程度,HE染色观察关节组织病理学变化;分离培养成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)和腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage,PMΦ);ARMET真核细胞表达质粒pCIneo-ARMET-FLAG,ARMET小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)分别转染体外培养的FLS;MTT法检测细胞增殖活性;免疫荧光染色观察细胞形态和蛋白定位;逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)和免疫印迹(Western Blot,WB)分别检测相关基因在mRNA及蛋白水平的变化;放射免疫测定法(Radioimmunoassay,RIA)检测细胞培养上清中白介素-1β(interlukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)水平;ELISA检测血清中ARMET、C-反应蛋白(C- reactive protein,CRP)、IL-1β及TNF-α水平。结果:1.免疫性关节炎动物模型的建立与评价1.1 mBSA诱导的兔关节炎模型的建立:关节腔内注射mBSA后,模型组兔出现明显的关节炎表现,膝关节红肿,活动受限;MRI扫描发现膝关节滑膜明显增厚,关节腔变窄;病理改变表现为滑膜组织增生,新生血管形成,炎性细胞浸润等;炎症滑膜组织中巨噬细胞的标志性蛋白白细胞分化抗原68(Cluster of Differentiation 68,CD68)和成肌纤维细胞的标志物平滑肌肌动蛋白α(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达明显增强;1.2大鼠AA模型的建立:AA大鼠致炎后d3～d12,表现为原发侧关节肿胀,行走不便,食欲减退,d12后出现继发侧关节肿胀,耳,尾出现炎性结节和红斑并伴有多发性全身关节病变,病理改变表现为膝关节滑膜组织增生,新生血管增多,血管翳形成,关节腔内可见淋巴细胞、浆细胞和单核细胞聚集,软骨和骨组织破坏等关节局部病理变化;外周血血清中TNF-α、IL-1β水平明显升高。以上结果提示mBSA诱导的兔关节炎和大鼠AA模型制备成功。2.免疫性关节炎症诱导的ER应激参与了炎症反应过程2.1炎症诱导ER应激:炎症滑膜组织中BiP的mRNA和蛋白水平明显增加,且在FLS、MLS中都有表达; AA大鼠PMΦ中BiP表达也明显增加,提示免疫性关节炎症能诱导滑膜细胞和PMΦ的ER应激。核转录因子CHOP在炎症滑膜组织中的表达略有增高,且仅表达于FLS,在MLS中不表达;而AA大鼠PMΦ中CHOP表达却明显增加,提示巨噬细胞的不同功能状态对ER应激的反应性不同。同时我们还发现模型组滑膜组织中滑膜素(Synoviolin/Hrd1)的mRNA和蛋白水平均明显增加,提示免疫性关节炎症能上调Synoviolin的表达。2.2 ER应激促进关节炎症进展:与正常FLS相比,模型组FLS的增殖能力明显增强,ER应激诱导剂tunicamycin能显著降低正常FLS的增殖,而对炎症FLS的增殖无明显影响,提示FLS对ER应激性损伤的敏感性下降,这可能是ER应激状态下滑膜细胞异常增殖的原因之一。另外,tunicamycin能促进炎症FLS中IL-1β,TNF-α的表达和分泌,从而进一步促进了滑膜细胞的异常增殖。3.免疫性关节炎症诱导ARMET表达及其与炎症程度的相关性3.1炎症诱导ARMET表达:在炎性增厚的滑膜组织中ARMET大量表达,且主要定位于α-SMA阳性细胞,在CD68阳性细胞中几乎不表达;而AA大鼠PMΦ中ARMET的表达明显增加,提示关节炎症能诱导ARMET表达,并且不同组织来源的巨噬细胞对ER应激的反应性不同。3.2炎症不同时期滑膜组织中ER应激及ARMET的表达情况:致炎后不同时期收集AA大鼠滑膜组织进行RT-PCR和WB检测,结果发现急性炎症期(d2左右)BiP表达明显升高,此后一直维持在较高的水平,到d28稍有下降;致炎d14左右ARMET表达明显升高,随后逐渐下降;而CHOP则一直维持在低水平缓慢上升的状态,提示ARMET参与了AA炎症反应的全过程,且对炎症刺激更为敏感。3.3炎症不同时期外周血中ARMET水平与炎症程度的相关性:致炎后d14,ARMET水平显著增高,随后逐渐下降,d28仍高于正常水平;同样,血清中CRP水平在致炎后一周内即明显升高,d14左右达到峰值,随后缓慢下降,与ARMET的变化趋势基本一致。相关性分析表明,AA大鼠血清中ARMET水平与继发性关节炎症状、血清中IL-1β和TNF-α水平呈负相关。提示炎症能诱导ARMET分泌,且血清中ARMET水平与关节炎症进展和程度密切相关。4. ARMET对成纤维样滑膜细胞增殖和炎症细胞因子产生的影响4.1 ARMET表达对FLS增殖的影响:ARMET过表达能抑制ER应激状态下FLS的增殖;下调内源性ARMET表达后,FLS的增殖能力增强;在体外培养的FLS中加入重组的人ARMET蛋白能剂量依赖性的抑制炎症滑膜细胞的增殖;4.2 ARMET表达对FLS表达和分泌IL-1β、TNF-α的影响:下调内源性ARMET表达使FLS表达和分泌IL-1β和TNF-α水平增加;而重组的人ARMET蛋白能剂量依赖性的降低FLS中IL-1β和TNF-α的表达和分泌。5.炎症诱导ARMET的核转运在AIA兔滑膜组织中,我们观察到ARMET在FLS中的定位与α-SMA表达量有关。α-SMA少量表达时,ARMET分布在胞浆中;而α-SMA大量表达时,细胞核内也有ARMET表达;体外培养的AA大鼠FLS中,未经tunicamycin处理的FLS中ARMET在胞核内表达很少,而在胞浆中含量较多;tunicamycin刺激24 hrs后,ARMET在细胞核内含量明显增多,而在胞浆中表达减少。提示tuncamycin能够诱导滑膜细胞中ARMET的核转运。结论:1)免疫性关节炎症能诱导ER应激,ER应激通过上调FLS中炎症因子的产生而起到促进炎症的作用;2)免疫性关节炎症上调ARMET表达,并且滑膜组织中表达ARMET的细胞类型主要为FLS;3) ARMET表达参与了AA大鼠炎症反应的全过程,且对早期炎症刺激敏感;4) AA大鼠PMΦ参与了炎症诱导的ER应激和ARMET表达,提示巨噬细胞的不同功能状态对ER应激的反应性不同;5) AA大鼠外周血中ARMET水平明显升高,并与继发性关节炎症状、血清中IL-1β、TNF-α和CRP水平具有相关性。提示炎症能诱导ARMET分泌,且血清中ARMET水平与关节炎症进展和程度密切相关。6) ARMET能抑制炎症滑膜细胞的增殖、减少炎症因子的产生;并且该作用可能与炎症诱导滑膜细胞中ARMET的核转运,进而参与下游基因转录调控有关。