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CRISPR/Cas9系统是最近发现的一种来自于细菌及古菌中的获得性免疫系统,已经被证明在真核生物及部分原核生物中能够进行基因编辑;由此衍生出的CRISPRi系统在抑制真核及原核细胞内基因转录方面也有较好的效果。本实验室研究的肺炎克雷伯氏菌作为一种工业生产菌在发酵生产 3-轻基丙酸(3-Hydroxypropionic acid,3-HP)、1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PDO)等重要平台化合物中优势明显。目前针对该菌分子改造缺乏系统的工具,而使用传统的方法则十分耗时耗力。本论文主要研究CRISPR/Cas9及CRISPRi系统在肺炎克雷伯氏菌中的表达及功能,并将其应用到肺炎克雷伯氏菌的代谢研究中。本研究首次证明CRISPR/Cas9系统在肺炎克雷伯氏菌中具有双链DNA切割的功能。通过在肺炎克雷伯氏菌中构建靶标多拷贝质粒的CRISPR/Cas9系统,用抗性有无来表征质粒是否被切割,证明该系统能在肺炎克雷伯氏菌中诱导表达,并且具有较高的活性。与此同时,在肺炎克雷伯氏菌中探究了 tet启动子调控的CRISPRi系统对质粒上绿色荧光蛋白表达的抑制效果,初步证明CRISPRi系统在肺炎克雷伯氏菌中具有较明显的抑制基因表达的功能,最高抑制率达到了 90%。肺炎克雷伯氏菌在发酵产3-HP的过程中会产生大量的乳酸,而乳酸作为3-HP的同分异构体对其后续分离纯化带来了较大的困难。利用CRISPRi的基因表达抑制作用,分别抑制了肺炎克雷伯氏菌中乳酸合成相关基因pmd4、ldhA、aldA、mgsA并且构建了同时靶标上述4个基因的菌株。发现ldhA为肺炎克雷伯氏菌发酵产乳酸的关键基因。单独抑制该基因或同时抑制4基因的菌株在摇瓶发酵都表现出较低水平的乳酸合成,而在5L发酵罐中乳酸合成都处于极低的水平(～lg/L),成功地降低了副产物的生成。说明CRISPRi系统在代谢工程中作为抑制基因表达的手段是很有潜力的。