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第一部分端粒结合蛋白TPP1在结直肠癌中的表达及临床意义目的：研究端粒结合蛋白TPP1在结直肠癌中表达以及与肿瘤临床病理特征的关系,探讨TPP1蛋白表达在结直肠癌发生发展中的作用。方法：应用免疫组织化学SP法检测78例结直肠癌组织以及20例癌旁正常大肠黏膜组织中TPP1蛋白的表达情况；采用卡方检验分析TPP1在结直肠癌组织与癌旁组织中表达差异以及TPP1蛋白表达与患者临床病理信息的关系。结果: TPP1在结直肠癌组织中阳性表达定位于细胞核,结直肠癌组织中阳性表达率为85.9%,在癌旁正常黏膜组织中阳性表达率25.0%,结直肠癌组织中TPP1的表达显著高于癌旁正常黏膜组织(P<0.05)。TPP1蛋白的表达与肿瘤的Duke’s分期、浸润深度及淋巴结转移密切相关,即Duke’s分期越晚、浸润深度越深、伴随淋巴结转移者,TPP1蛋白表达水平越高(P<0.05)。结论：端粒结合蛋白TPP1表达升高与结直肠癌发生发展过程密切相关,可能是抗肿瘤治疗靶点。第二部分端粒结合蛋白TPP1表达水平与结直肠癌细胞内在放射敏感性的相关性目的：研究结直肠癌细胞中端粒结合蛋白TPP1表达水平与端粒长度、内在放射敏感性的关系,以寻求预测肿瘤放射敏感性的分子靶点。方法：以五种结直肠癌细胞系(HCT116、HT29、SW480、LoVo和DLD1)为研究对象,采用Western blotting方法检测TPP1蛋白表达；采用克隆形成实验检测细胞内在放射敏感性；采用Southern blotting方法检测细胞端粒长度。结果:五种结直肠癌细胞中TPP1蛋白表达、端粒长度及放射敏感性均存在差异,TPP1蛋白表达水平与端粒长度正相关(R=0.9783,P<0.05),TPP1蛋白表达与结直肠癌细胞内在放射敏感性负相关(R=0.9792,P<0.05),即结直肠癌细胞中端粒结合蛋白TPP1表达水平越高则细胞端粒越长,对放射线越抗拒。结论:端粒结合蛋白TPP1表达水平、端粒长度及细胞内在放射敏感性三者之间存在显著相关性。TPP1和肿瘤细胞放射敏感性密切相关,可能是预测结肠癌细胞放射敏感性的指标。第三部分端粒结合蛋白TPP1过表达对HCT116细胞放射敏感性的影响及机制目的: TPP1是端粒结合蛋白复合体(Sheherin)的重要成员之一,对端粒稳态维持起到重要作用。我们前期研究发现TPP1在放射抗拒细胞系中表达升高,但是TPP1对肿瘤细胞放射敏感性的确切影响和机制尚不明确。本课题主要研究过表达TPP1对人结直肠癌细胞HCT116放射敏感性的影响,并初步探讨其作用机制。方法:采用人TPP1全长真核表达质粒pcDNA6-flag-TPP1及空载体转染HCT116细胞,杀稻瘟素(Blasticidin)筛选稳定转染细胞株；采用克隆形成实验检测细胞放射敏感性；采用流式细胞仪检测放射线照射前后细胞凋亡及细胞周期的变化；采用Western blotting方法检测TPP1、ATM、ATR、Chk1等蛋白表达水平变化；采用Southern blotting方法检测细胞端粒长度;采用端粒重复序列扩增方法(TRAP-PCR-ELISA)检测端粒酶活性变化；放射线照射前及照射后不同时间采用细胞免疫荧光方法检测DNA损伤修复情况,其中γ-H2AX代表总DNA损伤灶,TRF2与γ-H2AX的共定位代表端粒损伤灶(telomere dysfunction induced foci, TIF)。结果:成功构建过表达TPP1的HCT116-TPP1细胞株及空白对照HCT116-Mock。克隆形成实验表明,与空白对照HCT116-Mock相比,TPP1过表达组细胞HCT116-TPP1获得了显著的放射抗拒,表明端粒结合蛋白TPP1过表达可以导致放射抗拒。联合放射线照射,细胞周期检测显示TPP1过表达显著延长了放射诱导的G2/M期阻滞持续时间。Western blotting检测结果显示过表达TPP1显著提高了ATM和ATR蛋白表达水平。联合放射线照射,Western blotting检测磷酸化Chkl蛋白表达,结果显示TPPl过表达显著延长了放射诱导的磷酸化Chk1蛋白表达持续时间,与放射诱导细胞周期G2/M期阻滞趋势一致,提示端粒结合蛋白TPP1对细胞周期的调控是通过ATM/ATR-Chk1这一通路进行的。此外,TPP1过表达降低了HCT116细胞的放射诱导凋亡率。HCT116-TPP1细胞端粒较HCT116-Mock端粒长度显著延长但端粒酶活性未见明显改变。端粒损伤灶(TIF)检测结果显示：不论是在端粒部位还是非端粒部位,与HCT116-Mock相比,HCT116-TPP1细胞组放射诱导DNA损伤修复进程显著加快。结论:端粒结合蛋白TPP1具有保护端粒功能和诱导放射抗拒的作用。TPP1过表达可以通过调控细胞周期阻滞、抑制放射诱导凋亡和促进DNA损伤修复等途径促进放射抗拒。因此,TPP1和肿瘤细胞放射敏感性密切相关,可能是结直肠癌细胞放射增敏的潜在靶标。第四部分抑制端粒结合蛋白TPP1表达对HCT116细胞放射敏感性的影响及机制目的:研究干扰TPP1蛋白表达对人结直肠癌细胞HCT116放射敏感性的影响,并初步探讨其作用机制。方法：采用靶向人TPP1基因的干扰质粒pGPU6/Neo-shTPP1及相应阴性对照质粒shNC转染HCT116细胞,G418筛选稳定转染细胞株；采用Western blotting方法检测TPP1等蛋白表达水平变化；采用克隆形成实验检测细胞放射敏感性；采用流式细胞仪检测放射线照射前后细胞凋亡的变化；采用Southern blotting方法检测细胞端粒长度;采用端粒重复序列扩增方法(TRAP-PCR-ELISA)检测端粒酶活性变化；放射线照射前及照射后不同时间点采用细胞免疫荧光方法检测DNA损伤修复情况,其中y-H2AX代表总DNA损伤灶,TRF2与y-H2AX的共定位代表端粒损伤灶(telomere dysfunction induced foci, TIF);染色质免疫沉淀联合斑点杂交实验(Telomere-ChIP)检钡TRF2、 POT1、 hTERT以及γ-H2AX蛋白与端粒DNA序列的结合情况,分析干扰TPP1对这些蛋白在端粒定位的影响。结果:成功构建了TPP1蛋白表达抑制的细胞株HCT116-shTPPl及相应阴性对照HCT116-shNC, Western blotting验证转染效果。克隆形成实验表明,与阴性对照HCT116-shNC细胞相比,TPP1干扰组细胞HCT116-shTPP1放射敏感性显著增加,表明抑制端粒结合蛋白TPP1表达可以导致放射增敏。抑制TPP1表达促进HCT116细胞凋亡并显著增加了其放射诱导凋亡率。有趣的是,与过表达组结果类似,我们发现干扰TPP1导致HCT116细胞端粒延长但端粒酶活性未见显著变化。端粒损伤灶(TIF)检测结果显示HCT116-shTPP1细胞株端粒损伤灶点显著增加,提示抑制TPP1导致端粒失稳态；更重要的是,联合放射线我们发现与HCT116-shNC细胞相比,不论是在端粒部位还是非端粒部位,HCT116-TPP1细胞的放射诱导DNA损伤修复均受到抑制,即抑制TPP1蛋白表达显著抑制DNA损伤修复速度。Telomere-ChIP实验结果显示,与阴性对照HCT116-shNC细胞相比,HCT116-shTPP1细胞端粒上TRF2蛋白无显著变化,端粒部位γ-H2AX显著升高,POT1及hTERT蛋白与端粒结合显著下降。结论:抑制端粒结合蛋白TPP1表达可以通过促进端粒失稳态、促进辐射诱导凋亡和抑制DNA损伤修复等途径导致结直肠癌细胞HCT116放射敏感性增加。抑制TPP1表达可以影响γ-H2AX、POT1及hTERT蛋白与端粒的结合。总之,端粒结合蛋白TPP1和肿瘤细胞端粒稳态、放射敏感性密切相关,是结直肠癌细胞放射增敏的靶标。