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芥菜是我国南方广泛种植的十字花科蔬菜,它的品质和产量与开花时间早晚密切相关。例如,茎瘤芥提早抽薹开花会严重影响产品器官（瘤状茎）的膨大甚至导致茎瘤空心。适时开花是确保芥菜正常生长发育的关键因素,外在环境条件（光照和温度）和内在遗传因素等都会影响芥菜开花时间。开花调控基因分布于春化途径、光周期途径、赤霉素途径和自主途径等多种途径,并最终通过关键的开花信号整合子调节开花时间。其中MADS-box家族在众多开花调节因子中研究较多并起着较为关键的作用。例如开花整合子AGAMOUS-LIKE24（AGL24）和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1（SOC1）等。EARLY FLOWERING MYB PROTEIN（EFM）和SHORT LIFE（SHL）是两个新的开花调控因子,它们不属于MADS-box家族,它们在芥菜开花调控中的作用机制还不清楚。在拟南芥中,EFM可作为SVP的下游或FT的上游来调控开花;此外,对shl突变体转录组测序发现218个基因（包括MADS-box家族成员）的表达水平发生了变化,由此暗示:拟南芥EFM和SHL可能通过MADS-box因子调控开花。但是,芥菜EFM、SHL是否能够直接作用于MADS-box因子SOC1和AGL24（两个核心开花整合子）从而调节开花时间呢?目前仍不清楚。为此,本研究分别克隆了芥菜EFM、SHL基因并分析了它们的表达规律;同时利用蛋白原核表达系统和酵母双杂交方法,以及双荧光素酶检测系统和酵母单杂交方法,鉴定了EFM、SHL与开花整合子SOC1、AGL24之间的相互作用;此外,利用农杆菌浸染法进行转基因初步探讨了芥菜EFM和SHL的功能。这为深入研究芥菜EFM和SHL调控抽薹开花的精细作用机制奠定了基础。1.克隆了芥菜EFM、SHL基因以芥菜叶片总RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增,分别克隆了EFM、SHL基因,其CDS序列分别为1269 bp、690 bp,分别编码422和229个氨基酸。序列比对和系统进化树分析表明:Bju EFM、Bju SHL与甘蓝、芜菁等芸薹属植物亲缘关系较近。2.芥菜EFM、SHL在不同组织中的表达模式芥菜在长日照条件下生长60天后,采集其根、茎、叶、花和果荚（3个生物学重复）,利用q RT-PCR检测Bju EFM、Bju SHL在不同组织中的表达。结果发现:Bju EFM、Bju SHL在不同组织中均有表达。其中,Bju EFM在叶片中表达量最高,根中次之,在花中表达量最低;Bju SHL在花中表达量最高,叶片次之,在根、茎、果荚中表达较低但表达量相对稳定。3.芥菜EFM、SHL抑制植物开花通过农杆菌介导法分别构建了融合表达载体pCAMBIA2301G-EFM、p CAMBIA2301G-SHL,并将重组质粒转入农杆菌菌株EHA105中,利用芥菜遗传转化体系,获得了转基因芥菜植株,通过表型观察初步发现其开花时间延迟,表明Bju EFM、Bju SHL为开花负调控因子。4.芥菜EFM、SHL蛋白与SOC1、AGL24蛋白的相互作用检测分别构建酵母真核融合载体pGADT7-EFM、pGADT7-SHL、pGBKT7-EFM、p GBKT7-SHL以及原核蛋白表达载体p ET-32a（+）-EFM、p ET-32a（+）-SHL,并将其分别转入Y187、Y2HGold和Rosseta（DE3）感受态细胞中,通过酵母双杂与pull-down检测芥菜EFM、SHL蛋白与SOC1、AGL24蛋白之间的相互作用。酵母双杂交试验结果表明:Bju EFM、Bju SHL与Bju SOC1、Bju AGL24的融合蛋白均不能在QDO/X/A（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/Ab A）长出菌落,且不能变蓝,表明Bju EFM、Bju SHL与Bju SOC1、Bju AGL24不存在蛋白相互作用。通过原核表达诱导纯化后发现:His-EFM、His-SHL同样不能捕获GST-SOC1与GST-AGL24,说明Bju EFM、Bju SHL与Bju SOC1、Bju AGL24也不存在蛋白相互作用。两种研究方法得到的试验结果一致。5.芥菜EFM、SHL蛋白与SOC1、AGL24启动子的相互作用关系分别构建酵母重组载体pGADT7-EFM、pGADT7-SHL以及双荧光素酶载体p Green II62-SK-EFM、p Green II 62-SK-SHL,并将其分别转入Y187和GV3101+p Soup感受态细胞中,通过双荧光素酶实验和酵母单杂两种方法鉴定EFM、SHL蛋白与SOC1、AGL24启动子之间的相互作用。酵母单杂交实验发现:Y1H（SOC1+Bju EFM）和Y1H（SOC1+Bju SHL）均可在SD/-Leu/Ab A100上正常生长,而Y1H（AGL24+Bju EFM）、Y1H（AGL24+Bju SHL）却不能在SD/-Leu/Ab A350上长出菌落。由此表明:芥菜EFM、SHL蛋白与AGL24启动子没有相互作用,却与SOC1启动子存在相互作用。双荧光素酶实验也表明芥菜EFM和SHL蛋白只能与SOC1启动子结合,这与酵母单杂交实验的研究结果一致。