CpG ODN激活慢性HBV感染者免疫细胞功能的研究

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目的:探讨人工合成硫代修饰的含CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)作为佐剂对慢性HBV感染者PBMC、CD4~+T淋巴细胞、CD8~+T淋巴细胞和DC等各种免疫细胞产生免疫应答的影响,进一步阐明慢性HBV免疫发病机制,为慢性HBV肝炎患者开创新的免疫治疗方法提供实验基础。方法:应用密度梯度离心法,从随机选取的慢性HBV感染者(免疫耐受组和免疫清除组)和健康对照者的外周静脉血分离PMBC,部分病例通过免疫磁珠技术(IBT)进一步纯化CD4~+T淋巴细胞、CD8~+T淋巴细胞和DC,并经过流式细胞术(FCM)验证其分离效果,用CpG ODN、HBsAg、M[CpGODN~+HBsAg]、分别与试验者的PBMC、纯化的CD4~+T细胞和纯化的CD8~+T细胞孵育,采用ELISPOT检测慢性HBV感染者特异性Th1细胞反应和FCM检测CTL的激活能力,通过对感染者外周血中IFN-γ分泌量和CD8~+T淋巴细胞表面CD107表达情况的测定,判断CpG ODN激活慢性HBV感染者免疫细胞的能力。结果:HBsAg和M[HBsAg~+CpG ODN]分别与慢性HBV感染者的PBMC、纯化的CD4~+T细胞和CD8~+T细胞孵育后在不同免疫状态组内的比较:其中PBMC和纯化的CD4~+T细胞产生IFN-γ斑点数及纯化的CD8~+T淋巴细胞表面CD107的表达均没有显著性差异(P>0.05);但在免疫清除和正常对照组的PBMC中CD8~+T淋巴细胞表达的CD107有显著性差异(P免疫清除组=0.008和P健康对照组=0.007),且CD107a远高于CD107b的比例。另外,M刺激PBMC比纯化的CD4~+T细胞产生的IFN-γ斑点数多,且均有显著性差异(P=0.000);M刺激慢性HBV感染者PBMC、CD4~+T淋巴细胞和CD8~+T淋巴细胞,在不同免疫之间的两两比较:无论是PMBC和CD4~+T淋巴细胞产生的IFN-γ斑点,还是CD8~+T淋巴细胞表面CD107的表达均有显著性差异(P<0.05);另外,PBMC中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的纯化率均达到90%以上,纯化后的各类树突状细胞比例分别是pDC为30.28%、mDC-1为66.50%和mDC-2为0.04%。结论:处于免疫耐受和免疫清除状态下的慢性HBV感染者,CpG ODN可轻度增加HBsAg刺激PBMC、纯化的CD4~+T淋巴细胞分泌IFN-γ和纯化CD8~+ T淋巴细胞表面CD107a和CD107b的表达,但HBsAg与M比较无显著性差异,且CpG ODN对PBMC刺激效果优于CD4~+ T淋巴细胞。然而,在免疫清除状态,CpGODN能显著增加HBsAg刺激慢性HBV感染者PBMC中的CD8~+ T淋巴细胞表面CD107a和CD107b的表达。利用免疫磁珠技术分离PBMC中DC的方法对于研究纯化的DC功能具有切实可行的意义。
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