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目的:肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.P)广泛分布于自然界,是一种条件致病菌,定植在40%健康人群鼻咽部,可以引起肺炎、中耳炎、菌血症、脑膜炎等疾病。据统计在发展中国家,每年大约有500万5岁以下的儿童死于肺炎链球菌引起的肺炎及脑膜炎。随着抗生素的广泛使用,肺炎链球菌对青霉素耐药现象日益严重,且呈多重耐药,严重影响治疗效果,因此应用疫苗进行有效的预防显得尤为重要。肺炎链球菌有90多个血清型,其中近30个血清型对人有致病性,为细菌性肺炎的主要病原体。目前使用的疫苗多为型特异性多糖疫苗,难以覆盖所有血清型,且对2岁以下婴幼儿及老年人的保护效果不理想。因此,寻找新的候选疫苗是有效预防细菌性肺炎的关键。肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)为肺炎链球菌的黏附分子,是该菌所有血清型共有的一种遗传保守的、种特异性的表面蛋白抗原。PsaA在肺炎链球菌黏附呼吸道粘膜过程中发挥关键作用,是主要的毒力因子之一。PsaA抗原决定簇全部或部分暴露于细胞表面,具有较好的免疫原性。因此,PsaA蛋白有可能作为肺炎链球菌候选蛋白疫苗的抗原,同时还有可能用于检测患者血清中相应的抗体,为肺炎链球菌感染的快速诊断提供依据。本研究采取基因工程方法构建重组载体,经表达获得PsaA蛋白,并利用动物主动免疫来初步验证其保护作用,研究其作为疫苗抗原的可行性。方法:1.psaA基因的克隆、表达:利用PCR技术从肺炎链球菌基因组中扩增psaA片段,克隆后构建在原核表达载体pET-32a中;经测序与GenBank数据库中肺炎链球菌全基因组的psaA片段进行比对,将含有目的基因片段的重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,饱和硫酸铵纯化蛋白;应用SDS-PAGE电泳技术对表达产物进行分析,并用自制的小鼠抗血清进行Western blot鉴定。2.主动免疫实验:将40只昆明小鼠随机分为2组(每组20只),分别为生理盐水对照组和PsaA实验组。实验组分别于0、14、21天经腹股沟皮下注射PsaA蛋白,剂量为10μg/只/次,对照组注射无菌生理盐水。免疫结束后第7天对两组小鼠经腹腔感染致死剂量肺炎链球菌,连续监测21天,进行生存时间分析。结果:1.psaA基因的克隆、表达:经快速PCR鉴定、酶切鉴定和基因测序结果显示,肺炎链球菌psaA基因片段被正确克隆到pET-32a原核表达载体中,核苷酸序列长度为870bp,与GenBank中相应序列完全符合,无碱基突变;经IPTG诱导,重组质粒在BL21(DE3)菌中表达出了分子量约为57kD的Trx-PsaA融合蛋白(PsaA蛋白约为37KD,硫氧还原蛋白约20KD),表达的蛋白以可溶形式为主,表达量约占全菌总蛋白的60%,饱和硫酸铵纯化后纯度大于80%;重组蛋白能够与S.P免疫小鼠的抗血清发生结合反应。2.重组蛋白PsaA的主动免疫实验结果:以PsaA蛋白免疫的小鼠半数生存时间与对照组相比明显延长(P<0.001)。结论:1.成功构建了pET-32a-psaA重组表达载体。表达的重组蛋白PsaA具有良好的抗体结合活性。为肺炎链球菌感染的快速诊断抗原的制备提供实验依据。2.PsaA蛋白能够保护昆明小鼠抵抗致死剂量肺炎链球菌的攻击,具有一定的免疫保护性,为肺炎链球菌蛋白疫苗的研制奠定了基础。