第一章胃癌淋巴道转移相关基因的筛选　　 目的：　　 筛选胃癌淋巴道转移相关基因，并对兴趣基因进行验证，探讨胃癌淋巴道转移的机制；并研究淋巴管来源的CXCL1在胃癌淋巴道转移中的作用。　　 方法：　　 胃癌SGC7901(5×106)细胞注射于裸大鼠爪垫，建立胃癌淋巴结转移动物模型。移植瘤周围注射Evans蓝，显示胭窝淋巴结(前哨淋巴结)和其输入淋巴管。分离前哨淋巴结的输入淋巴管。原代培养淋巴管内皮细胞，采用间接法磁珠分选，流式细胞学检测分离的细胞纯度，免疫组织化学(VEGFR-3、LYVE-1、podoplanin)鉴定细胞。胭窝淋巴结连续切片，HE(hematoxylin and eosin)染色确定是否肿瘤转移。收集胃癌细胞转移到前哨淋巴结后培养的输入淋巴管内皮细胞，Agilent基因表达谱芯片筛选与对照淋巴管内皮细胞的差异表达基因。利用软件筛选差异表达基因，RT-PCR方法对基因芯片的有关差异基因进行验证。　　 我们挑选上调表达的CXCL1作为兴趣基因。观察CXCL1对SGC7901细胞的趋化作用，研究CXCL1的受体CXCR2在SGC7901细胞和125例胃癌组织中的表达情况，分析CXCR2的表达与临床病理参数和淋巴管密度(lymphatic vesselsdensity，LVD)之间的关系。体外建立淋巴管内皮细胞和SGC7901细胞的共培养体系，观察淋巴管内皮细胞CXCL1的表达情况和调节的机制。研究共培养后淋巴管内皮细胞迁移和小管形成能力的变化，并观察CXCL1siRNA及CXCR2受体阻断剂SB225002对共培养内皮细胞的迁移和小管形成能力的影响，并分析参与分子的表达变化。　　 结果：　　 胃癌爪垫裸大鼠移植瘤成功。原位瘤早期(2周)显微手术成功分离前哨淋巴结的输入淋巴管。贴壁培养的淋巴管周围爬出上皮样细胞，间接法磁珠分选LYVE+的细胞，流式细胞学证实分选的LYVE+细胞比例95％以上。LYVE-1、podoplanin、VGFR-3免疫细胞化学染色结果显示所培养的为淋巴管内皮细胞。Agilent芯片杂交结果荧光信号强度较一致，实验体系稳定，芯片平均检出率(即有表达的基因)70.74％。根据差异倍数大于2并且具有统计学意义(P＜0.01)筛选了846个差异表达的基因，其中457个上调，389个下调。RT-PCR检测Timp2、EphrinB1、FoxC2、Igfbp3、SMAD7、CXCL1、Oldlr1、Agt和Lrp3基因表达趋势，和芯片结果符合。根据内皮细胞的功能以及潜在与淋巴管新生和肿瘤转移的关系，挑选了一系列相关的基因：趋化和生长因子、脉管发生和模式、脉管压力、细胞粘附和类固醇合成等。包含至少四个差异基因且具有统计学意义的信号通路包括：过氧化物酶增殖体激活受体、钙信号转导途径、细胞因子和受体作用、补体与凝集的级联反应、细胞外基质受体以及细胞间隙连接、Wnt信号途径、黏着斑激酶信号途径、类固醇合成途径、ABC转运蛋白、胰岛素信号途径。　　 芯片结果提示CXCL1基因上调表达3.3倍，RT-PCR结果提示升高6.2倍。我们发现CXCL1因子对SGC7901细胞有趋化作用。CXCL1受体CXCR2在SGC7901细胞上呈阳性表达，而在125例胃癌组织中，其中80例CXCR2呈阳性表达。其表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移和远期转移有关。此外CXCR2的表达与LVD相关。体外建立共培养体系，发现淋巴管内皮细胞的CXCL1表达上调，而且CXCL1表达上调与NF-κBp65的核转位有关。CXCL1表达上调后淋巴管内皮细胞迁移和小管形成能力增强。CXCL1siRNA及CXCR2受体阻断剂SB225002可以阻断这种变化。CXCL1表达上调导致的淋巴管内皮细胞迁移和小管形成能力增强与p-FAK(Tyr-397)、p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、p-Rho A(Ser-188)蛋白表达上调相关，CXCL1siRNA及CXCR2受体阻断剂SB225002可以下调共培养的LECs的p-FAK(Tyr-397)、p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、p-Rho A(Ser-188)蛋白的表达。　　 结论：　　 成功构建了前哨淋巴结的输入淋巴管内皮细胞在肿瘤转移后的差异基因表达谱。筛选了一系列与淋巴管内皮细胞的功能和淋巴管新生及肿瘤转移的相关的基因和信号通路。　　 CXCL1/CXCR2在胃癌淋巴管新生和淋巴结转移中起重要作用。CXCL1促进胃癌细胞迁移，其受体CXCR2在胃癌组织中表达与LVD密切相关。淋巴管来源的CXCL1在促进肿瘤淋巴结转移中发挥重要作用。　　 第二章 AEG-1与胃癌预后关系的研究　　 目的：　　 研究星形细胞上调基因-1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)在胃癌组织中的表达情况，分析其与预后的关系；探讨AEG-1对胃癌细胞生长、凋亡及迁移、侵袭的影响及其机制；初步探讨抑制AEG-1表达胃癌细胞对5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)的敏感性的分子机制。　　 方法：　　 Western blot检测AEG-1在胃癌细胞(AGS，SGC7901，MGC803，MKN28和MKN45)中的表达。免疫组织化学检测105例胃癌组织及其中对应30例癌旁组织AEG-1的表达情况。结合临床和随访资料，分析其与临床病理参数之间的关系。生存分析采用Kaplan-Meier法。单因素采用x2检验，多因素分析采用Cox回归模型。　　 采用RT-PCR方法筛选特异抑制AEG-1表达的siRNA，Western blot检测其抑制效果。观察AEG-1下调后对胃癌SGC7901生物学行为的影响。MTT检测生长，流式细胞学检测细胞凋亡，Transwell小室观察细胞的迁移和侵袭。Westernbolt检测AEG-1下调后胃癌Wnt/β-catenin信号通路蛋白的表达。观察Wnt信号通路激活剂氯化锂对AEG-1 siRNA处理后β-catenin表达的影响。　　 观察AEG-1 siRNA对SGC7901细胞5-Fu的耐药曲线和半数抑制浓度(IC50)的影响，RT-PCR检测胃癌细胞AEG-1siRNA处理后5-Fu代谢的关键酶-二氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD)的表达变化。　　 结果：　　 AEG-1在五种胃癌细胞中均有表达，其中在低分化的胃腺癌细胞株(SGC7901和MKN45)中的表达高于在高分化或者中等分化的癌细胞株的表达(AGS、MGC803和MKN28)。在我们105例病人标本中，66例(62.9％)胃癌组织呈阳性表达。AEG-1的表达与胃癌的浸润深度、淋巴结转移、远处转移以及TNM分期明显相关(P值分别为0.000，0.004，0.026和0.000)。AEG-1的表达与Ki-67增殖指数相关。生存曲线分析发现AEG-1过表达与胃癌预后明显相关，AEG-1高表达的患者的五年的生存率为28.78％，中位生存期为23个月，而AEG-1表达阴性的生存率为61.5％，中位生存期为38个月，差异具有统计学意义(P＜0.01)。单因素分析其他因子T分期、淋巴结转移和远处转移以及TNM分期与胃癌的预后相关。Cox模型中发现，TNM分期、淋巴结转移和AEG-1过表达是胃癌独立的预后因素。　　 si-002对AEG-1表达的抑制效应最强。AEG-1下调可以抑制胃癌SGC7901细胞的生长，胃癌细胞的早期凋亡比例增加。AEG-1siRNA处理细胞能明显抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。AEG-1siRNA能下调p-AKT(S473)、p-GSK3β(S9)、β-catenin、Lef-1和cyclinD1的表达。AEG-1siRNA明显抑制氯化锂刺激的β-catenin的表达。　　 转染 AEG-1 siRNA的SGC7901细胞与未转染的细胞及仅转染阴性对照siRNA的细胞相比，细胞耐药性明显降低，IC50值明显下降(P＜0.05)。SGC7901细胞表达一定量的DPDmRNA，而且经5-Fu处理后，表达水平升高。AEG-1 siRNA可以下调DPDmRNA的表达。　　 结论：　　 AEG-1与胃癌的进展有关，是胃癌独立的预后因素。AEG-1下调抑制胃癌细胞的生长，促进细胞的凋亡，抑制细胞的迁移和侵袭。AEG-1参与Wnt/β-catenin信号通路的调节，而且AEG-1可能通过DPD影响5-Fu化疗的效果。