【摘 要】
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[目的]艾滋病,又称获得性免疫缺陷综合征（Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）,它形成的原因是人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）攻击人的免疫细胞使人的免疫屏障受损。艾滋病严重威胁着人类健康和社会经济的发展,还是一个严重威胁人类公共健康的跨世纪难题。据初步统计,从截至到2019年10月底,我国累计确定HIV
【基金项目】
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国家自然科学基金（8166130086）；
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[目的]艾滋病,又称获得性免疫缺陷综合征（Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）,它形成的原因是人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）攻击人的免疫细胞使人的免疫屏障受损。艾滋病严重威胁着人类健康和社会经济的发展,还是一个严重威胁人类公共健康的跨世纪难题。据初步统计,从截至到2019年10月底,我国累计确定HIV病毒携带者约95.8万人,相比前一年新增13.1万例,报告病人死亡28.4万例。在最近的20年里,HAART已在HIV感染者中广泛应用,很大程度上降低了 AIDS患者的死亡率。越来越多的研究者探索逆转录酶抑制剂在抑制病毒复制方面的作用。NNRTIs在HAART疗法中占据重要组成部分,它们是一类具有疏水性小分子的化合物,结构多样,通常只对HIV-1 RT有抑制作用。随着NNRTIs在HIV-1感染者中的广泛应用,耐药株的逐渐出现降低了药物的活性。而且,全球HIV-1感染者日益增多,促使我们研发对耐药株敏感的、低毒的NNRTIs。本研究采用一个新发现的吲哚衍生物RJQ-1,确定其有效的抗病毒活性,然后采用q-PCR方法探索其作用于HIV-1病毒的复制过程。对相关耐药突变进行表型分析和基因型鉴定,然后与已有突变位点进行比较分析,可以进一步帮助我们了解化合物与HIV-1逆转录之间的作用机制,为开发耐药屏障更高、毒性更小的非核苷类逆转录抑制剂（NNRTIs）提供研发思路。[方法]1.用体外耐药株诱导的方法,在体外诱导化合物RJQ-1的耐药株,如果化合物RJQ-1对自身诱导耐药株的EC50升高到100倍以上,则表明耐药株诱导成功。2.用CPE和ELISA方法,检测化合物RJQ-1对自身诱导耐药株的EC50值。3.用基因克隆的方法检测耐药病毒株的基因型。4.用软件MEGA7.0进行序列比对,发现是否有新的突变位点。5.用单点突变试剂盒对质粒pNL4-3进行单点突变,送去公司测序,然后进行序列比对,确定是否突变成功。6.对单点突变正确的质粒转染到293T细胞内,48h后收集上清于-80℃保存。7.检测化合物RJQ-1和EFV对单点突变病毒株的抑制作用。8.用q-PCR方法检测化合物RJQ-1对病毒HIV-1逆转录过程的抑制作用。[结果]1.用体外耐药株诱导的方法,在体外诱导化合物RJQ-1的耐药株,用CPE和ELISA方法,检测化合物RJQ-1对自身诱导耐药株的EC50分别为138.08μg/mL、>200 μg/mL,化合物RJQ-1对自身诱导耐药株的EC50升高到100倍以上,表明耐药株HIV-1 ⅢmB/RJQ-1诱导成功。2.用基因克隆的方法检测耐药病毒株的基因型,测序结果用软件MEGA7.0进行序列比对,发现新的突变位点Y181C。3.检测化合物RJQ-1和EFV对单点突变病毒株的抑制作用.EC50分别为74.22μg/mL,2.99 nM。4.用q-PCR方法检测化合物RJQ-1对病毒HIV-1逆转录过程的抑制作用,发现化合物很可能抑制病毒HIV-1逆转录过程最初始的R/U5的合成。[结论]本研究采用一个新发现的吲哚衍生物RJQ-1,然后采用q-PCR方法,研究其对HIV-1病毒复制过程的抑制作用,发现化合物很可能抑制病毒HIV-1逆转录过程的最初始阶段R/U5的合成。通过对相关耐药突变进行表型分析和基因型鉴定,并与已有突变位点进行比较分析,发现耐药株HIV-IⅢB/RJQ-1氨基酸序列出现一个新的突变位点Y181C,该位点与已有的研究报告指出的NNRTIs常见的耐药突变位点一致[1],进一步帮助我们了解化合物与HIV-1逆转录之间的相互作用机制,而且也为开发耐药屏障更高、毒性更小的非核苷类逆转录抑制剂（NNRTIs）提供研发思路。
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