黄河鲤ZP2和HORMAD1基因的cDNA克隆和表达分析

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动物在进化过程中生殖方式由无性生殖到有性生殖,越来越复杂,其中一个关键环节就是两性个体的形成。两性个体的形成主要经过两个过程:性别决定和分化。为了充分了解性别决定和分化的分子机制,科学工作者一直致力于寻找性别决定和分化的相关基因。黄河鲤是我国十分重要的淡水鱼类资源之一,但是由于过度捕捞、工业废水造成的水污染以及黄河流域断流等一系列的人为和自然因素,造成黄河鲤种质资源的急剧减少,在这样的情况下科学家们开始人为地保护及繁殖黄河鲤的种质资源,因此了解黄河鲤的性别决定以及分化的相关分子机制具有十分重要的意义。本研究首先在黄河鲤的性腺抑制性消减杂交文库中筛选到两个性腺差异表达的ESTs,在这两个ESTs的基础上进行RACE扩增,得到两个全长cDNA序列。经过Blast比对后,认为这两个基因是ZP2和HORMAD1,随后利用DNAMAN、Signal P、Mega等多种生物学软件对这两个基因进行分析,并实验测定了其在黄河鲤成体不同组织中的表达情况。ZP基因家族编码产生ZP蛋白,它是脊椎动物卵细胞外非细胞质基质的主要组成成分,不仅对卵细胞起着物理保护的作用,而且在受精过程中起着作为精子受体、诱导顶体反应以及阻止多精入卵等重要的作用。黄河鲤的ZP2基因的cDNA全长共有1788个核苷酸,开放阅读框长1716bp,编码产生571个氨基酸和一个终止密码子(TAA)。氨基酸同源性比对结果显示黄河鲤的ZP2基因的氨基酸序列在ZP功能域、信号肽、TFF结构域、内部疏水基团、弗林蛋白酶酶切位点和外部疏水基团等结构上具有很高的同源性,说明ZP2基因的这些序列具有很高的保守性。系统进化分析结果显示,鱼类的ZP2基因在进化上与哺乳类的ZP2基因亲缘性较远,反而与哺乳类的ZP1基因具有较近的亲缘关系。在结构和进化分析上发现鱼类的ZP2基因更倾向于与哺乳动物的ZP1基因同源。半定量RT-PCR和荧光定量qRT-PCR结果显示,该基因只在卵巢中特异转录,在其他成体组织中没有检测到该基因的表达。HORMAD蛋白在细胞周期调控和减数分裂过程中有着重要的作用,主要涉及染色体轴的形成,染色体之间的活动(配对、联会和重组),DNA损伤修复等,在配子形成过程中,HORMAD蛋白不可或缺。黄河鲤HORMAD1基因cDNA的全长序列共1327bp,开放阅读框共有921bp的核苷酸,编码产生306个氨基酸外加一个终止密码子(TGA)。对HORMAD1进行生物信息分析,在其中有一个保守的HORMA功能域,没有发现信号肽序列。氨基酸序列比对结果表明HORMA功能域具有较高的保守性,系统进化分析发现黄河鲤的HORMAD1基因与青鳉、东方红鳍鲀等鱼类的HORMAD1在系统进化上具有较近的亲缘关系。半定量RT-PCR和荧光定量qRT-PCR的结果显示,在黄河鲤的成体的不同组织中HORMAD1基因只在精巢中转录表达,在其他组织中不表达。这两个基因都只在黄河鲤的性腺中特异表达,猜测其是否与黄河鲤的性别决定或性别分化有关,关于这方面的功能仍需要进行进一步的深入研究。
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