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目的： 阻塞性黄疸是一种由于各种原因导致的肝内外胆管阻塞，胆汁无法通过正常通道排出而淤积在体内所致的一种临床症状，常见于肝内外肿瘤、胰头肿瘤、结石嵌顿等疾病，肝功能在一定程度受到损害，机体发生复杂的病理生理改变。阻塞性黄疸存在特殊的痛觉现象，对伤害性刺激不敏感即痛阈增高。在临床工作中痛阈增高容易导致患者就诊延迟、围术期麻醉镇痛药物使用相对过量、呼吸抑制、苏醒延迟等，不利于病人术后恢复。本课题的目的是探索黄疸患者中枢增高的胆红素(Bilirubin)通过与脊髓背角的5-羟色胺3A(5-hydroxytryptamine3A，5-HT3A)受体结合激活γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)能神经元，通过促进抑制性递质GABA的合成释放和增强GABA神经元抑制性活动介导阻塞性黄疸的痛阈增高。 方法： 1、通过胆总管结扎（bile duct ligation，BDL）创建阻塞性黄疸的模型，采用全自动生化分析仪分析血清和脑脊液中肝功能各项指标的改变。BDL和胆红素鞘内注射测定Sprague-Dawley(SD)大鼠的痛阈。BDL、胆红素鞘内注射和脊髓背角神经元培养后，通过western blot的方法观察5-HT3受体各亚型的表达变化，并通过免疫荧光观察BDL后脊髓切片神经元激活情况和5-HT3A受体表达变化。 2、通过鞘内注射5-HT3A受体拮抗剂、GABAA受体拮抗剂、GABAB受体拮抗剂后测定BDL大鼠痛阈的变化。脊髓背角神经元培养鉴定GABA能神经元上5-HT3A受体的表达情况，并进一步通过western blot的方法观察BDL、胆红素鞘内注射和脊髓背角神经元培养胆红素干预后GABA受体各亚型的表达变化，并通过酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)测定脑脊液内GABA浓度。电生理技术记录5-HT3A受体激动剂和胆红素对脊髓背角GABA能抑制性突触后电流(spontaneous inhibitory postsynaptic current，sIPSC)的影响以及应用5-HT3A受体拮抗剂后电流变化。 3、通过慢病毒将携带目的基因的质粒转染进入人胚肾293细胞(human embryonic kidney293，HEK293)构建过表达人5-HT3A受体的HEK293细胞(HEK293-5-HT3A)，电生理膜片钳观察胆红素和5-HT3A受体激动剂对细胞内向电流的影响。放射性配基结合实验测定胆红素和5-HT3A受体的亲和力大小，并通过同源建模和分子对接的方法模拟预测胆红素和5-HT3A受体的空间结构、结合方式以及结合位点。 结果： 1、胆总管结扎术后大鼠血浆总胆红素(total bilirubin，TB)、直接胆红素(direct bilirubin，DB)和间接胆红素(indirect bilirubin，IB)、胆汁酸(total bile acid，TBA)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)均随着BDL时间增加而增加，而脑脊液中仅有TB和IB升高，且在3、5、7天显著高于sham组。BDL后大鼠机械痛阈和热痛阈显著升高，鞘内直接注射胆红素后大鼠机械性痛阈和热痛阈显著高于注射前。BDL3d大鼠鞘内注射昂丹司琼抑制了胆总管结扎大鼠的痛阈升高，且具有浓度依赖性。BDL、胆红素鞘内注射以及胆红素直接培养大鼠脊髓背角神经元后5-HT3A受体表达逐渐增加。免疫荧光显示BDL后5-HT3A受体表达高于假手术组，且活化的神经元数量增加，活化的神经元同时高表达5-HT3A受体。 2、鞘内给予昂丹司琼(ondansetron)、荷包牡丹碱(bicuculline)显著降低黄疸大鼠的痛阈，而CGP55845对痛阈的降低作用较弱。且昂丹司琼、荷包牡丹碱抑制了鞘内注射5-HT3A受体激动剂mCPBG、胆红素诱导的痛阈增高。脊髓背角神经元培养免疫荧光染色显示培养的GABA能中间神经元多数表达5-HT3A受体，且BDL、胆红素鞘内注射大鼠以及胆红素直接培养脊髓背角神经元后GABAA受体表达增加，昂丹司琼在一定程度抑制GABAA受体的表达。ELISA提示BDL和胆红素鞘内注射后脑脊液内GABA浓度明显增加，昂丹司琼干预后GABA水平有短暂下降。电生理记录提示mCPBG、胆红素增强GABA能神经元的sIPSC，而昂丹司琼干预后mCPBG、胆红素对sIPSC的作用减弱。 3、胆红素诱发HEK293-5-HT3A细胞产生内向电流。放射性配基结合实验证实胆红素同5-HT3A受体有较弱的亲和力，两者以能量较低的方式相结合。胆红素能够进入5-HT3A受体亚基之间形成的疏水间隙，两者在空间结构上具有良好的互补性，并且有氢键形成。 结论： 本研究可得出如下结论: 1、胆红素通过5-HT3A受体增高阻塞性黄疸的痛阈。 BDL后大鼠机械性痛阈和热痛阈显著升高，且脑脊液内胆红素水平增加。鞘内注射胆红素同样增加大鼠痛阈，且可被5-HT3A受体拮抗剂所抑制。同时5-HT3A受体在胆红素干预后表达明显增加，且脊髓背角神经元活性增加。 2、胆红素通过5-HT3A受体影响GABA通路的功能。 5-HT3A受体激动剂、胆红素鞘内注射均可增高大鼠痛阈，这种效应可被5-HT3A受体拮抗剂、GABA受体拮抗剂所抑制。同时，5-HT3A受体在培养的脊髓背角GABA能神经元上大量表达，且GABAA受体在胆红素干预后蛋白表达明显增加，GABA浓度在BDL和胆红素鞘内注射后显著增加。 3、胆红素与5-HT3A受体以氢键相结合。 胆红素能够诱发HEK293-5-HT3A细胞产生内向电流，且放射性配基结合实验证实胆红素同5-HT3A受体的亲和力较弱，提示两者以共价键或离子键等结合的可能性较小。同源建模和分子对接进一步证实了胆红素能够进入5-HT3A受体两个亚基之间形成的疏水间隙，两者在空间结构上具有良好的互补性，并且有氢键形成。 阻塞性黄疸中枢升高的游离胆红素能够与脊髓背角的5-HT3A受体以氢键相结合，从而增强GABA能中间神经元的活动，参与黄疸患者的痛阈增高。