目的先天性耳廓畸形是整形外科常见的先天性出生缺陷,对患者的心理及生理发育均具有较大影响。目前的研究显示,先天性耳廓畸形与多种遗传及环境因素相关,而遗传因素是导致先天性耳廓畸形的重要原因。先天性耳廓畸形的病因学研究及临床治疗是本疾病相关研究的重要组成部分。目前基于我国先天性耳廓畸形患者的家系研究、基因编辑动物模型研究、致病机制研究及基于大量病例的治疗方法对比及选择研究均较为缺乏。为探究我国先天性耳廓畸形的致病基因及个性化临床治疗策略,我们设计了本课题,主要研究目的如下:1.通过对临床工作中收集的家系患者及健康样本进行研究分析,确定家系患者致病基因突变位点。2.构建先天性耳廓畸形基因编辑小鼠模型。3.对基因编辑小鼠模型进行基因突变-表型分析,探索先天性耳廓畸形的发生机制。4.回顾先天性耳廓畸形临床治疗病历资料,总结先天性耳廓畸形个性化手术治疗策略。对象及方法1.选取临床工作中收集的三个先天性耳廓畸形大家系共32例患者血液样本及2000例健康样本,应用全基因组连锁分析技术、靶向捕获结合二代测序技术,对样本DNA进行致病基因定位及基因拷贝数分析,筛选可能与先天性耳廓畸形相关的基因变异。2.根据上述研究中发现的致病基因变异,应用CRISPR/Cas9技术构建先天性耳廓畸形基因编辑小鼠模型。3.观察分析小鼠耳部表型,进行基因突变-表型分析,进一步揭示该基因变异与先天性耳廓畸形之间的关系,应用Realtime-PCR等方法,观察该基因变异对相关基因表达的影响,进一步探索先天性耳廓畸形的发生机制。4.回顾2017年1月至2018年1月就诊于本团队的618例先天性耳廓畸形患者的病历资料,对手术细节、并发症及处理方法、耳廓再造术后效果进行归纳总结。结果1.位于人类第4染色体,距离HMX1基因1OOkb,HMX1基因与CPZ基因之间的拷贝数变异,chr4:8701900-8702500(hg19),是本研究中先天性耳廓畸形家系患者的致病基因突变。2.根据上述致病基因突变,成功构建先天性耳廓畸形基因编辑小鼠模型,获得基因敲入(Duplication,DUP)、基因敲除(Knockout,KO)两种基因编辑小鼠。基因敲入(DUP)小鼠耳部表现为小鼠双侧耳廓整体变小,耳廓上部缺失,呈现弧形缺损,耳廓外侧变尖,耳廓呈三角形,与家系患者耳部表型一致;基因敲除(KO)小鼠耳部表现为小鼠双侧耳廓整体增大,耳部扁平呈扇形,耳廓内部褶皱消失,颅耳角增大接近90°,近似于人类招风耳畸形表型。3.基因敲入(DUP)、基因敲除(KO)、野生型(WT)三种基因型小鼠的Realtime-PCR结果显示,基因敲入小鼠HMX1基因表达显著高于野生型及基因敲除小鼠。因此,该致病基因拷贝数增加,增强了 HMX1基因的表达,可能是其导致先天性耳廓畸形的机制之一。4.2017年1月至2018年1月,共618位先天性耳廓患者于本团队进行耳廓再造,其中289位患者进行了 Nagata两次法耳廓再造术,176位患者进行了扩张双瓣法耳廓再造术,153位患者进行了扩张单瓣法耳廓再造术。术后平均随访时间为12个月,随访非常满意者507位,满意者61位,不满意者29位,21例失访,满意率95.1%。结论1.本研究发现了致病基因拷贝数变异位点chr4:8701900-8702500(hg19),这是第一个通过我国先天性耳廓畸形患者样本发现的致病基因位点。2.本研究成功构建了先天性耳廓畸形基因编辑小鼠模型,在小鼠模型中复制了先天性耳廓畸形家系患者的耳部表型。3.以先天性耳廓畸形拷贝数变异基因编辑小鼠模型为基础,进一步探索该基因变异位点导致先天性耳廓畸形的相关机制,初步确定该基因拷贝数增加所导致的HMX1基因表达增强,可能是其导致耳廓畸形的机制之一。4.通过Nagata两次法耳廓再造术、扩张双瓣法耳廓再造术及扩张单瓣法耳廓再造术在大量先天性耳廓畸形病例中的应用,总结了三种方法的适用条件,为先天性耳廓畸形的治疗提供参考。