目的:　　 研究人牙龈成纤维细胞(humangingivalfibroblasts，HGFs)与不同配比的壳聚糖/明胶/卡拉胶牙龈组织工程支架材料复合后的生长增殖情况及其分泌Ⅰ型胶原(TypeⅠCollagen，ColⅠ)和结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)的情况，筛选出最适合HGFs生长的壳聚糖/明胶/卡拉胶支架材料。初步探讨CTGF对HGFs在该支架微环境下分泌ColⅠ的影响，为研究牙龈组织工程支架材料提供实验依据。　　 方法:　　 1.HGFs的原代培养、传代及来源鉴定　　 采用组织块培养法原代培养HGFs，酶消化法进行传代培养，抗角蛋白染色及波形丝蛋白染色进行细胞来源鉴定。　　 2.HGFs与不同配比的壳聚糖/明胶/卡拉胶支架复合培养　　 (1)采用改良乳化冷凝聚合法制备不同配比的壳聚糖/明胶/卡拉胶支架。实验分四组，实验组一:5％卡拉胶+壳聚糖+明胶;实验组二:10％卡拉胶+壳聚糖+明胶;实验组三:15％卡拉胶+壳聚糖+明胶;对照组:壳聚糖+明胶。（每组壳聚糖、明胶的比例均为1∶1）　　 (2)将HGFs接种于四组支架材料后，在培养的1、3、5、7天时MTT法检测HGFs在四组支架材料上的增殖情况，酶联免疫吸附实验(Enzyme-linkedImmunosorbentAssays，ELISA)法检测HGFs在四组支架材料上ColⅠ和CTGF的分泌情况。在复合培养的第7天扫描电子显微镜(ScanningElectronicMicroscope，SEM)和显微CT(Micro-CT)观察支架形态以及细胞在支架上的生长情况。筛选出最适合HGFs生长的壳聚糖/明胶/卡拉胶支架材料。　　 3.相同方法以及条件将HGFs分别接种于上述实验筛选出的支架材料上进行体外复合培养，在培养基中加入anti-CTGF抗体（对照组为不含anti-CTGF抗体的培养基），在培养1、3、5、7天时ELISA法检测细胞上清液中ColⅠ和CTGF的浓度。　　 结果:　　 1.采用组织块培养法成功培养出原代HGFs。倒置相差显微镜下见5～7天后即有细胞从组织块周围游出，细胞呈长梭形，放射状排列。15～20天细胞铺满培养瓶底90％左右。传代后细胞呈长梭形，胞核圆，核仁清晰。免疫组化染色波形蛋白抗体体阳性，抗角蛋白抗体阴性。　　 2.SEM结果显示支架孔径在50-200μm之间，SEM和Micro-CT结果均示各组支架材料具有良好的孔隙率和互相连通的孔径结构。　　 3.MTT法检测HGFs的增殖活性显示:细胞培养第1天对照组OD值大于实验组;第3、5、7天实验组OD值大于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，且实验组一OD值大于其余实验组，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 4.ELISA法检测上清液中ColⅠ和CTGF含量结果显示:细胞与支架复合培养第1、3、5、7天实验组分泌ColⅠ的浓度大于对照组，且实验组一大于其余实验组，差异有统计学意义（P＜0.05）;第1、3、5、7天对照组CTGF的浓度小于实验组，第3、5、7天时实验组一大于其余实验组，差异有统计学意义(P＜0.05);复合培养第1、3、5、7天，随着时间的增加，对照组、实验组一、实验组二细胞上清液中ColⅠ的浓度增加，同时CTGF的浓度也增加。　　 5.ELISA法检测上清液中ColⅠ和CTGF浓度结果显示:加入anti-CTGF抗体的实验组中细胞上清液的ColⅠ和CTGF的浓度均小于未加anti-CTGF抗体的对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 结论:　　 1.组织块细胞培养法是原代培养HGFs的传统经典的方法，是后期实验成功的前提和基础。　　 2.本研究发现壳聚糖/明胶/卡拉胶支架（5％卡拉胶+壳聚糖+明胶）与对照组和其余实验组支架相比，有利于HGFs的生长和繁殖，其生物学行为更加活跃，更适合作为组织工程化牙龈的生物支架材料。　　 3.CTGF在壳聚糖/明胶/卡拉胶支架促进HGFs分泌ColⅠ的过程中，有可能起了一定的作用，其具体机制还有待进一步研究。