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[目的]课题组前期研究发现,重楼皂苷Ⅰ(PPⅠ)对MCF-7、MCF-7/ADM细胞具有明显的抑制作用,且低细胞毒浓度的PPⅠ可能通过抑制P-gp的表达和ERK、JNK磷酸化逆转MCF-7/ADM细胞耐药。ERK、JNK信号通路可以影响细胞周期,对细胞周期的影响可能是PPⅠ逆转乳腺癌耐药的机制。本研究拟进一步检测低细胞毒浓度的PPⅠ对MCF-7/ADM细胞P-gp功能和细胞周期的影响,探讨低细胞毒浓度PPⅠ逆转MCF-7/ADM细胞耐药的深入机制。[方法]1.采用流式细胞术,检测 0.3、1、3μmol/LPPⅠ 作用 48h,对 MCF-7、MCF-7/ADM细胞内ADM、Rh123的蓄积的影响;并在荧光显微镜下观察细胞内荧光强度的变化。2.采用细胞计数仪计数,绘制MCF-7、MCF-7/ADM细胞的生长曲线,计算倍增时间;3.采用流式细胞术,检测1、3μmol/LPPⅠ单独或联合ADM作用24h,对MCF-7、MCF-7/ADM细胞周期各时相分布的影响。4.采用Western blot法,检测1、3μmol/LPPⅠ单独或联合ADM作用于MCF-7/ADM 细胞 24h 后,对 CyclinD1、CDK4、CDK6、p16、CyclinE1、CDK2、p53、p21、p27、Rb、P-Rb蛋白表达的影响。[结果]1.MCF-7细胞内ADM和Rh123的平均荧光强度(MFI)均显著强于MCF-7/ADM细胞;1、3μmol/LPPⅠ呈浓度依赖性增加MCF-7/ADM细胞内ADM的MFI值,增加倍数为2.00(P<0.05)、2.90倍(P<0.01);VER增加倍数为4.18(P<0.001)。同样,1、3μmol/LPPⅠ呈浓度依赖性增加MCF-7/ADM细胞内Rh123的MFI值;增加倍数为1.84(P<0.01)、4.04倍(P<0.001);VER增加倍数为4.92倍(P<0.001)。3μmol/LPPⅠ 作用于 MCF-7 细胞 48h,胞内 ADM、Rh123 平均荧光强度分别减弱1.72(P<0.01)、21.37倍(P<0.001)。荧光显微镜下观察,MCF-7细胞内ADM和Rh123的荧光强度均显著强MCF-7/ADM细胞。1、3μmol/LPPⅠ呈浓度依赖性增加MCF-7/ADM细胞内ADM和Rh123的荧光强度;而对MCF-7细胞内ADM和Rh 123的荧光强度影响不明显。2.经计算,MCF-7细胞倍增时间约为64小时;MCF-7/ADM细胞倍增时间约为47小时。与MCF-7比较,MCF-7/ADM细胞G0/G1期从73.37%减少至67.87%(P<0.05),G2/M 期从 18.07%增加至 22.13%(P<0.05),MCF-7/ADM 细胞增殖更旺盛。3.对于MCF-7细胞,Control组G0/G1期、S期和G2/M期的细胞比例分别为73.37%、8.13%和18.07%,1μmol/LADM作用24h后,S期和G2/M期分别增加至 39.13%(P<0.001),31.37%(P<0.001);1、3μmol/LPPⅠ 及 10μmol/LVER,对细胞周期分布无明显影响;ADM组G0/G1期比例为28.23%,1、3μmol/L PPⅠ与ADM联合,呈浓度依赖性增加G0/G1期细胞比例至39.87%(P<0.05)、48.87%(P<0.001);VER 与 ADM 联合作用,增加至 46.23%(P<0.01)。对于 MCF-7/ADM细胞,Control组G0/G1期、S期和G2/M期的细胞比例分别为67.87%、9.60%和22.13%,1μmol/LADM作用24h,对细胞周期分布无明显影响;1、3μmol/L PPⅠ 增加 G0/G1期至 73.63%(P<0.05),77.77%(P<0.01);10μmol/L VER单独作用,无明显影响。ADM组G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例分别为65.80%、11.53%和22.13%,1、3μmol/LPPⅠ与ADM联合作用,增加G0/G1期细胞比例至 75.63%(P<0.05),78.90%(P<0.001);VER 与 ADM 联合作用,增加 S 期、G2/M 期细胞比例至 14.07%(P<0.05)和 35.93%(P<0.01)。4.与 MCF-7 细胞比较,MCF-7/ADM 细胞中 CyclinD1、CDK4、CDK6、p16、CyclinE1、p53均呈高表达,上调倍数分别为1.55(P<0.01)、1.46(P<0.001)、1.42(P<0.01)、2.24(P<0.001)、2.29(P<0.001)、9.31(P<0.001);CDK2、p21、p27和Rb均呈低表达,下调倍数分别为1.73(P<0.01)、4.11(P<0.001)、6.88(P<0.001)和2.91(P<0.001);P-Rb在两株细胞中的表达无明显差异。5.1、3μmol/LPPⅠ作用MCF-7/ADM细胞24h,与对照组相比,一方面呈浓度依赖性下调 CyclinD1、CDK4、p16、CyclinE1、p53、Rb、P-Rb 等蛋白表达,3μmol/L PPⅠ 下调倍数分别为 1.33(P<0.01)、1.39(P<0.05)、1.51(P<0.01)、1.70(P<0.001)、2.33(P<0.001)、14.46(P<0.001)、4.30(P<0.001)。另一方面呈浓度依赖性上调p21、p27的表达,3μmol/LPPⅠ上调倍数分别为2.39(P<0.001)、5.80(P<0.001)。3μmol/L PPⅠ联合ADM作用时,下调CyclinD1、CDK4、p16、P-Rb 的表达,下调倍数依次为 1.25(P<0.05)、1.78(P<0.01)、1.57(P<0.001)、9.63(P<0.001);上调 p21、p27 的表达,上调倍数分别为 3.11(P<0.001)、3.07(P<0.001)。VER联合ADM作用时,可明显下调p16、p21、p27、P-Rb,下调倍数分别为 1.71(P<0.001)、2.41(P<0.05)、1.85(P<0.05)、2.14(P<0.01),p53表达略上调,上调倍数为1.13(P<0.05)。[结论]1、MCF-7/ADM细胞发生耐药的机制,除了 P-gp高表达使外排功能增强,降低胞内ADM的浓度,使ADM无法发挥增殖抑制作用以外,可能与MCF-7/ADM细胞中 G1/S 检查点调控因子 CyclinD1、CDK4、CDK6、p16、CyclinE1、p53 高表达,而CDK2、p21、p27、Rb低表达,促进MCF-7/ADM细胞周期进程,使MCF-7/ADM细胞处于G2/M期的比例更多,增殖更旺盛,倍增所需时间更短有关。2、低细胞毒浓度的PPⅠ可能通过抑制P-gp的外排功能,增加化疗药的胞内蓄积,使化疗药达到有效浓度,抑制乳腺癌细胞增殖,逆转MCF-7/ADM细胞的化疗耐药。3、低细胞毒浓度的PPⅠ单独作用或与ADM联合作用,均可将MCF-7/ADM细胞阻滞在G0/G1期,其内在机制为抑制CyclinD1-CDK4/Rb信号通路,同时显著上调负性调控因子p21、p27的表达,阻止细胞跨过G1/S检查点。4、ADM可将MCF-7细胞周期阻滞在S期和G2/M期,而发挥增殖抑制作用,但对MCF-7/ADM细胞周期无影响。低细胞毒浓度的PPⅠ可能通过其本身的Go/G1期阻滞作用,以及与蓄积增加的ADM发生协同作用来逆转MCF-7/ADM细胞对ADM的耐药性,但PPⅠ本身的G0/G1期的阻滞作用可能掩盖了 ADM对S期和G2/M期的阻滞作用。