团头鲂(Megalobrama amblycephala)作为我国重要淡水养殖鱼类,目前面临着种质资源退化以及养殖环境恶化的问题。和四大家鱼相比团头鲂缺氧耐受能力差,导致其很难适应急剧恶化的养殖环境,尤其是缺氧环境。另外,团头鲂自身性情暴躁、容易受惊,极易对不良环境产生应激。上述因素极大制约了团头鲂养殖的可持续发展。因此本研究对不同溶氧浓度及处理时间条件下团头鲂行为学、生理生化、非特异性免疫相关指标和环境应激相关蛋白表达进行了分析;同时获得了prolyl hydroxylases(phd)家族3个基因phd1、phd2和phd3序列,并对phds进行生物信息学、时空表达及甲基化水平等分析,为耐低氧团头鲂品种/品系的培育提供一定的理论基础。本研究主要结果如下:1.低氧处理前后团头鲂行为学变化低氧处理后团头鲂呼吸频率从常氧条件下的平均182次/min增加到平均245次/min,并且鱼嘴张合幅度增加,团头鲂也从水体底部和中部游到上层水体进行水面呼吸(Aquatic surface respiration,ASR)。当水体溶氧水平继续下降并且接近团头鲂窒息点溶氧0.5 mg/L时,团头鲂身体失去平衡。复氧处理后团头鲂上述行为也逐渐恢复到正常状态。整体上低氧处理后团头鲂自发性活动频率增加。2.低氧处理前后团头鲂生理生化指标变化团头鲂血红蛋白、高铁血红蛋白、血糖、Na+、琥珀酸脱氢酶和乳酸水平在不同溶氧(dissolved oxygen,DO)浓度包括对照(DO:5.5 mg/L)以及急性低氧(DO:3.5和1.0 mg/L)处理后,随着溶氧浓度的下降而逐渐升高,肝糖原水平逐渐下降。团头鲂血红蛋白、高铁血红蛋白、血糖和乳酸含量随着低氧时间(0.5 h和6 h DO:3.5 mg/L)延长而升高,Na+和肝糖原水平下降,琥珀酸脱氢酶含量不变。复氧后上述7项指标水平全部下降。3.低氧处理前后团头鲂非特异性免疫指标变化团头鲂干扰素alpha和溶菌酶水平随着溶氧浓度的下降而逐渐升高,而白蛋白水平则逐渐下降。另外,随着低氧时间的延长团头鲂干扰素alpha水平升高,而白蛋白和溶菌酶水平则降低。复氧后上述3项指标水平全部升高。4.低氧处理前后团头鲂环境应答蛋白的表达变化Western blot分析显示Heat shock protein 70(Hsp70)在团头鲂组织中表达两条带,其中较小的Hsp70条带通过hsp70内部核糖体进入位点翻译。较大Hsp70在团头鲂肝脏、脾脏、脑、鳃和肾脏中检测到表达,而较小Hsp70仅在肝脏、脾脏和鳃中检测到表达。Hypoxia-inducible factor 1 alphs(Hif-1α)在团头鲂肝脏、脾脏和鳃中的蛋白水平随着溶氧浓度下降以及低氧处理时间的增加而升高。5.团头鲂phds基因cDNA和启动子扩增及序列特征作者设计开发了基于生物信息学和多重PCR技术的高效c DNA和启动子扩增方案,获得了团头鲂phd1、phd2和phd3的c DNA全长和启动子序列,该方法也在其他鱼虾中进行了有效性验证。生物信息学分析显示3个phds基因均包含5个外显子(exons),编码的氨基酸序列都含有脯氨酸羟基化酶结构域P4Hc,该区域中包含3个铁离子结合位点(氨基酸H、D和H残基),而Phd2的N末端还有一个zf-MYND结构域。启动子分析显示Phd1和phd3启动子中都包含低氧应答元件(hypoxia response element,HRE)结合位点。双荧光素酶活性进一步分析显示phd3启动子中5个HRE位点对Hif-1α做出应答,其中HRE1、HRE2和HRE3应答活性较强。6.团头鲂phds的表达分析时空表达谱分析显示团头鲂phd1在胚胎发育过程中的眼囊期表达量最高;常氧条件下该基因在血液、脑和心脏中表达较高,但低氧处理后,其在血液、肌肉、脑、心脏和肠表达下降,在鳃表达升高。另外,作者也发现phd1可以通过选择不同的起始密码子而表达出两种蛋白,并且两种蛋白都位于细胞核中,其中较大蛋白可以促进细胞增殖。团头鲂phd2在16-细胞期、囊胚早期和囊胚中期表达量较高;常氧条件下该基因在肌肉和鳃表达最高,低氧处理后其在血液、肝脏、脾脏、肌肉和心脏中的表达量下降。而团头鲂phd3在胚胎发育的早期表达;常氧条件下该基因在肝脏表达最高,而低氧后其在所检测的9个组织中都上调表达。另外,作者也发现phd3存在两种不同的选择性剪接体,并且这两个剪接体都可被低氧诱导表达。7.TDN-PCR分析团头鲂phds甲基化水平团头鲂phd1在低氧敏感和耐受个体的肌肉组织中表达差异不显著,phd2在低氧敏感和耐受个体肌肉组织表达差异显著,而phd3在低氧耐受个体中表达量较高,在低氧敏感个体中几乎检测不到表达。为了分析候选基因启动子的甲基化对基因表达的影响,作者设计开发了特异性和灵敏性较高的Touch-down based nest-PCR(TDN-PCR)用于DNA甲基化分析,结果表明团头鲂低氧敏感和耐受个体的phd2和phd3启动子上CpG区域没有甲基化,而phd1启动子上有2个甲基化区域。为了进一步在团头鲂低氧敏感和耐受群体中分析phd1启动子区域的甲基化水平,作者利用TDN-PCR技术的高分辨率溶解曲线(high-resolution melting,HRM)方法对其进行了检测,结果显示团头鲂phd1启动子高甲基化程度与低氧敏感群体显著正相关。8.TDN-PCR分析鱼类phd1甲基化水平通过TDN-PCR扩增来自鲤形目、鲈形目和鳢形目的几种鱼phd1启动子并测序分析,结果显示鱼类phd1启动子甲基化越高则窒息点越高,鱼对低氧越敏感,即甲基化程度与窒息点呈正相关。